何 楊，段 斐，靳 祎，王恩軍

(1河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北保定071000;2華北油田總醫(yī)院)

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸(Fructus Corni)的干燥果肉，又名山萸肉、藥棗、肉棗等。其味酸、澀、微溫，歸肝腎經(jīng)，有補(bǔ)益肝腎、澀精固脫之功效，是我國的傳統(tǒng)中藥材［1，2］?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)山茱萸對腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用［3～5］。2010年5～11月，我們采用人宮頸癌Hela細(xì)胞作為實驗?zāi)Ｐ停芯可杰镙撬崛∥矬w外抗宮頸癌活性，探討山茱萸的抗癌機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 山茱萸水提取物由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院提供，每1 g相當(dāng)于原生藥2 g。制成500 mg/ml的溶液，高壓滅菌4℃保存，原生藥購自河北安國。人宮頸癌細(xì)胞株Hela由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院提供。

1.2 儀器與試劑 CO2培養(yǎng)箱:美國SHELDON公司;凈化工作臺:蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;酶標(biāo)儀:鄭州博塞生物工程公司;倒置顯微鏡:上海光學(xué)儀器五廠;48孔及96孔培養(yǎng)板:美國Costar公司;胎牛血清:杭州四季青生物工程材料有限公司;DMEM培養(yǎng)液和胰蛋白酶:GIBCO公司;順鉑:齊魯制藥有限公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO):美國Sigma公司;瓊脂糖:北京拜爾迪生物公司;200 bp DNAmaker:華美生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將Hela細(xì)胞貼壁生長于DMEM完全培養(yǎng)液體系(含10%胎牛血清，青霉素和鏈霉素各100 U/ml)，置于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長至對數(shù)生長期時用DMEM完全培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105個/ml的細(xì)胞懸液待用。

1.3.2 MTT法檢測山茱萸水提取物對Hela細(xì)胞增殖的抑制作用 按1×105個/ml的細(xì)胞密度將Hela細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板中，終體積為每孔200 μl。實驗分3組，陰性對照組加入生理鹽水，陽性對照組加入順鉑(濃度為20 μg/ml)，實驗組加入不同劑量的山茱萸水提取物，分別為每孔10、20、40、80 μl，并設(shè)4個平行孔，分別培養(yǎng)24、48和72 h后加入 MTT 液(5 μg/μl)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入DMSO每孔150 μl，震蕩15min，測定吸光度值(OD值)，測定波長 λ=570 nm，參考波長 λ=630 nm，計算抑制率=(對照組OD值－實驗組OD值)/對照組OD值×100%。

1.3.3 形態(tài)學(xué)觀察 取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞接種于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h，實驗組每孔加入20 μl的山茱萸水提取物，對照組加入生理鹽水，培養(yǎng)48 h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.3.4 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析 取對數(shù)生長期細(xì)胞5瓶，每瓶含有1×106個細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液把山茱萸水提取物稀釋成不同濃度(0、25、50、100、200 mg/ml)，分別加入5個培養(yǎng)瓶中，加培養(yǎng)液至5 ml，培養(yǎng)48 h后用原有培養(yǎng)液吹起細(xì)胞，收集離心，吸去上清液，加入1 ml磷酸緩沖液洗兩次，然后提取DNA，在2%瓊脂糖凝膠上電泳2 h，電壓為80 V，紫外透視儀觀察、拍照。

1.3.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 The SAS system 6.12軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量數(shù)據(jù)以±s表示，采用t檢驗和雙因素方差分析(F檢驗)。以P≤0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 對Hela細(xì)胞增殖的抑制作用 各組作用48 h后對Hela細(xì)胞抑制作用比較見表1;山茱萸水提取物對Hela細(xì)胞抑制作用的時效關(guān)系見表2。

表1 各組作用48 h后對Hela細(xì)胞抑制作用比較(n=4，±s)

表1 各組作用48 h后對Hela細(xì)胞抑制作用比較(n=4，±s)

注:與陰性對照組比較，*P ＜0.05，△P ＜0.01

組別 OD值 抑制率(%)0.219 ±0.012 －陽性對照組 0.021±0.025△ 90.40±0.20△實驗組10 μl 0.106 ±0.033* 51.22 ±0.23*20 μl 0.077 ±0.014△ 60.51 ±0.33△40 μl 0.038 ±0.032△ 82.46 ±0.41△80 μl 0.023 ±0.026△ 89.53 ±0.17陰性對照組△

表2 山茱萸水提取物對Hela細(xì)胞抑制作用的時效關(guān)系(n=4，±s)

表2 山茱萸水提取物對Hela細(xì)胞抑制作用的時效關(guān)系(n=4，±s)

注:與24 h比較，*P ＜0.05，△P ＜0.01

24 h 48 h 72 h 10 μl 44.28 ±0.24 51.22 ±0.23* 54.16 ±0.27劑量 抑制率(%)△20 μl 53.60 ±0.47 60.51 ±0.33* 61.31 ±0.18*40 μl 76.43 ±0.19 82.46 ±0.41* 82.64 ±0.30*80 μl 84.52 ±0.31 89.53 ±0.17* 90.15 ±0.39*

2.2 形態(tài)學(xué)觀察 對照組宮頸癌Hela細(xì)胞呈扁平的不規(guī)則長梭形或多角形，核圓形，位于中央，排列無方向性，細(xì)胞邊緣清楚，培養(yǎng)基內(nèi)懸浮的細(xì)胞和碎片少。實驗組山茱萸水提取物作用Hela細(xì)胞，胞膜起皺，細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞膜完整，培養(yǎng)基內(nèi)懸浮的細(xì)胞和碎片多。

2.3 DNA凋亡帶的觀察 Hela細(xì)胞經(jīng)不同濃度山茱萸水提取物處理48 h后，電泳檢測均可見斷裂DNA片段，細(xì)胞DNA呈現(xiàn)典型的180～200 bp的梯形條帶，即為“DNA Ladder”。表明一定量的山茱萸水提取物可誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡。

3 討論

宮頸癌是一種嚴(yán)重危害婦女健康和生命的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，在全球婦女惡性腫瘤中僅次于乳腺癌。臨床上宮頸癌主要采取手術(shù)、放化療等綜合治療，但它們所帶來的并發(fā)癥也很多，而且化療藥物本身費(fèi)用昂貴、久易耐藥、毒性較大。而傳統(tǒng)中醫(yī)藥積累了大量治療婦科疾病的經(jīng)驗與驗方，辨證論治對減少宮頸癌化療和放療的副作用均有較好的輔助作用，這對鞏固和加強(qiáng)宮頸癌的治療效果，延長患者生命和保證生存質(zhì)量是具有積極意義的［6］。

關(guān)于山茱萸的藥理活性，目前報道較多的有其抗衰老、增強(qiáng)免疫的作用，而其他研究卻甚少。本實驗使用人宮頸癌Hela細(xì)胞作為代表細(xì)胞株，采用MTT法觀察山茱萸水提取物對人宮頸癌細(xì)胞的作用。結(jié)果表明，不同劑量山茱萸水提取物處理細(xì)胞后，Hela對MTT的代謝能力均有不同程度的降低，山茱萸水提取物對Hela細(xì)胞增殖有較強(qiáng)的抑制作用，抑制程度與山茱萸水提取物的濃度和作用時間有關(guān)。另外山茱萸水提取物作用于細(xì)胞后，可見較為典型的細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，而且不同劑量山茱萸水提取物作用于Hela細(xì)胞后，細(xì)胞的生長受到明顯抑制，有DNA Ladder凋亡條帶的出現(xiàn)，說明山茱萸水提取物能誘導(dǎo) Hela細(xì)胞凋亡［7，8］，這為今后進(jìn)一步研究山茱萸的抗腫瘤作用機(jī)制提供了實驗依據(jù)。

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