譚震宇

浙江省桐廬縣中醫(yī)院（浙江桐廬311500）

外治法是中醫(yī)治療方法的一個重要組成部分，主要是通過肌膚、孔竅施治，可以達(dá)到通經(jīng)貫絡(luò)的功能，深入腠理、臟腑，有效調(diào)整陰陽氣血［1］。復(fù)方馬錢子凝膠具有活血通絡(luò)、祛風(fēng)散寒、消腫止痛之功。本研究為進(jìn)一步評價其抗炎鎮(zhèn)痛作用及其鎮(zhèn)痛抗炎的機(jī)理，通過觀察復(fù)方馬錢子凝膠對模型動物痛閾值影響的實驗研究，旨在發(fā)現(xiàn)運用中醫(yī)外治法治療傷科疼痛病證的有效方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑Labsystems Dragon Wellscan MK-3全自動多功能酶標(biāo)儀；YLS-3E電子壓痛儀，由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站研制。酶標(biāo)測定儀由濰坊醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗中心提供。PB602-E型分析電子天平，瑞士梅特勒-托利生產(chǎn)。Carbomer940為北京鑫洲科技有限公司產(chǎn)品，Azone為福建壽寧美菲思生物化學(xué)品廠，血清IL-6 ELISA試劑盒為美國R&D公司產(chǎn)品。40%甲醛為重慶川東化工集團(tuán)公司產(chǎn)品；5%甲醛溶液以稀釋40%甲醛而成；雙氯芬酸二乙胺乳膠劑（扶他林），由北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)。

1.2 實驗動物SD大鼠由濰坊醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，體質(zhì)量180～200g，自由飲水及進(jìn)食，大學(xué)實驗動物中心提供的標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，動物室通風(fēng)良好。

1.3 實驗藥物在80℃的條件下，取復(fù)方馬錢子生藥材（制馬錢子、當(dāng)歸、細(xì)辛、祖師麻、白芍、川芎、防風(fēng)、桂枝等）水煎濃縮，含生藥量2.4g/g浸膏，將原藥材去渣濃縮成棕黑色藥膏。取卡波姆加入適量的雙蒸水待溶解腫脹完全后，加甘油研勻，再加丙二醇和月桂氮酮和無水乙醇，研勻使完全溶解腫脹，攪拌均勻，另取三乙醇胺滴定，中和酸堿到pH6～6.5適量，得到空白凝膠，避光密封保存［2］。氮酮在低濃度（2.5%）時就能極大增強藥物的透皮作用［3］。使用空白凝膠基質(zhì)加復(fù)方馬錢子藥膏，分別配制成含生藥0.5、0.25、0.125g/g 3個劑量的復(fù)方馬錢子凝膠，避光密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 造模方法本研究采用注射大鼠右后足跖底部復(fù)制疼痛模型，甲醛誘導(dǎo)大鼠炎癥痛模致炎模型［4］。大鼠甲醛致炎性疼痛模型選用陽性對照藥物扶他林乳膠劑。

1.5 大鼠痛閾值的觀察致炎前首先采用壓痛儀測定各組大鼠右后足跖的原始痛閾。然后將50只雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組（給予外敷基質(zhì)凝膠10g/kg），陽性對照組（外敷扶他林乳劑10g/kg）、復(fù)方馬錢子凝膠高、中、低劑量組（分別按相應(yīng)劑量外敷復(fù)方馬錢子凝膠10g/kg）。每日3次，第4日每只大鼠右后足跖皮下注射5%甲醛溶液0.1mL致炎，致炎后立即在右后足局部涂抹藥物，測定致炎后 6、24、48、72h 的痛閾值并記錄結(jié)果［5-6］。 實驗結(jié)束后，處死大鼠，取大鼠血液離心血清-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 大鼠血清中白細(xì)胞介素-6（IL-6）測定采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），按照說明書建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測孔中加入血清樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL，反應(yīng)板置37℃孵育 30min； 洗板 4～6次， 加入酶標(biāo)工作液 50μL，37℃孵育30min；洗板 4次，先后加入A、B顯色劑各 50μL，37℃避光孵育15min；每孔加終止液50μL，450nm波長處測吸光值（OD值）。最小檢測質(zhì)量濃度5ng/L，最大質(zhì)量濃度為160ng/L。記錄每孔OD值結(jié)果，并繪制標(biāo)準(zhǔn)品的劑量反應(yīng)曲線，其回歸方程為Y=85.501-57.739X，r2=0.9853。查找血清樣本中IL-6的質(zhì)量濃度，記錄樣本質(zhì)量濃度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)以（±s）表示，應(yīng)用 SPSS18.0統(tǒng)計軟件。對各組結(jié)果進(jìn)行方差分析（ANOVA）以基質(zhì)組為共用對照組進(jìn)行Dunnett-t檢驗，比較各組的差異性，配合直線回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)方馬錢子凝膠給藥后對甲醛致大鼠甲醛致足跖壓痛差值的影響見表1。分別在6、24、48、72h各時間點對5個組進(jìn)行方差分析， 結(jié)果為 6h F=12.92；24h F=3.447；48h F=25.083；72h F=20.887；各時間點比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 復(fù)方馬錢子凝膠對甲醛致足跖疼痛大鼠IL-6的影響隨給藥劑量增大對IL-6表達(dá)的抑制越明顯，各給藥組大鼠血清中IL-6水平，均顯著低于空白對照組（P<0.05），馬錢子凝膠高劑量組IL-6降低最為顯著（P<0.05）。見表2。

3 討 論

中醫(yī)藥界自古就重視中藥體外用藥的途徑，先后創(chuàng)制出一系列外用藥物劑型［3］。中醫(yī)素有“內(nèi)病外治”的理念，復(fù)方馬錢子凝膠針對中醫(yī)疼痛產(chǎn)生的機(jī)理，在臨床上有一定的療效［4，7］。方中馬錢子性溫，有大毒，有通絡(luò)散結(jié)，消腫定痛的功效，為君藥；祖師麻辛溫有小毒，能祛風(fēng)散寒除濕、活血散瘀止痛，細(xì)辛辛溫有毒，祛風(fēng)散寒止痛力強，共為臣藥；當(dāng)歸、白芍養(yǎng)血活血，川芎祛風(fēng)行氣止痛，防風(fēng)祛風(fēng)散寒，桂枝散寒通絡(luò)止痛，同為為佐使；全方共奏祛風(fēng)散寒、行氣活血、通絡(luò)止痛之功，可達(dá)到治療痛證之目的［8］。

表1 各組給藥后大鼠甲醛致足跖壓痛差值比較 （±s）

表1 各組給藥后大鼠甲醛致足跖壓痛差值比較 （±s）

組 別 n 6h空白對照組 10-21.53±9.38陽性對照組 10 13.44±7.43 24h-22.52±6.95 22.50±13.55 48h-22.58±9.26 28.48±16.48 72h-15.51±5.80 26.39±15.27復(fù)方馬錢子凝膠低劑量組 10 22.45±10.02 24.65±7.12 19.73±7.69 15.45±12.99復(fù)方馬錢子凝膠中劑量組 10 23.10±12.47 18.34±9.40 20.78±7.38 22.21±10.21復(fù)方馬錢子凝膠高劑量組 10 24.64±16.44 43.00±16.3036.98±21.5329.34±19.32

表2 各組大鼠血清 IL-6水平比較 （ng／L，±s）

表2 各組大鼠血清 IL-6水平比較 （ng／L，±s）

與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組 別 n IL-6空白對照組 10 93.05±24.69陽性對照組 10 54.09±28.19*復(fù)方馬錢子凝膠低劑量組 10 46.32±25.03*復(fù)方馬錢子凝膠中劑量組 10 41.47±15.26*復(fù)方馬錢子凝膠高劑量組 10 33.32±25.29**

文獻(xiàn)報道［5］，在急性炎癥時IL-6及急性期反應(yīng)物產(chǎn)生會增加甲醛引起的繼發(fā)性炎性疼痛，它刺激C纖維末梢和周圍細(xì)胞釋放各種炎性介質(zhì)如組胺、前列腺素和緩激肽等，進(jìn)一步使感受傷害性刺激的初級傳入纖維興奮。凝膠劑是一種新型外用劑型，適用于皮膚、黏膜及腔道，能容納的藥物類型較廣，凝膠劑中一般均可選擇性添加透皮吸收促進(jìn)劑，促使藥物吸收加快和完全，較快地發(fā)揮療效。其中炎癥調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-6是一組由淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生的免疫活性因子，參與機(jī)體的免疫反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)和炎癥調(diào)節(jié)等重要作用。實驗發(fā)現(xiàn)在甲醛炎痛模型大鼠血清中，檢測到了空白對照組IL-6水平顯著升高，復(fù)方馬錢子凝膠治療組IL-6水平顯著下降，同時伴有痛閾升高，提示復(fù)方馬錢子凝膠的抗炎鎮(zhèn)痛作用可能與下調(diào)IL-6的表達(dá)及升高痛閾值有關(guān)?？赡芘c抑制大鼠體內(nèi)相關(guān)免疫細(xì)胞及其他多種相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6，減輕炎癥介質(zhì)的釋放。與朱建偉等［6］證實馬錢子具有較強的鎮(zhèn)痛作用一致。復(fù)方馬錢子凝膠除了有明顯鎮(zhèn)痛作用的祖師麻、馬錢子、細(xì)辛外，還含有白芍、當(dāng)歸、川芎等養(yǎng)血活血等藥物，能改善炎癥局部組織微循環(huán)，有效地抑制軟組織損傷的炎性反應(yīng)，加強大鼠鎮(zhèn)痛作用方面具有顯著的協(xié)同效應(yīng)。

綜上所述，本文觀察復(fù)方馬錢子制劑的抗炎、鎮(zhèn)痛作用及其對疼痛相關(guān)細(xì)胞因子的影響，同時提示了抑制IL-6活性可能成為治療炎癥相關(guān)性疼痛的有效途徑，進(jìn)一步證明了復(fù)方馬錢子凝膠在急性炎癥疼痛方面的優(yōu)勢，但其機(jī)理有待系統(tǒng)、深入、細(xì)致的研究。

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