楊青平，俞發(fā)榮，車紅霞，張梅，胡瑞萍，王擒虎，石磊

2型糖尿病發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，約占糖尿病群體總數(shù)的95%，已成為嚴(yán)重危害人類健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題。糖尿病及其并發(fā)癥不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，同時(shí)也是致殘、致死的重要原因。因此，建立合適的2型糖尿病模型，對(duì)于篩選預(yù)防和治療糖尿病的有效藥物，研究糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病、治療、預(yù)防和轉(zhuǎn)歸有重要意義。據(jù)報(bào)道[1-5]，植物中二苯乙烯類化合物具有明顯的降糖作用。對(duì)人工合成的二苯乙烯的降糖作用研究尚未見報(bào)道。本研究采用給予脂肪乳和鏈脲佐菌素的方法建立2型糖尿病大鼠模型，研究人工合成的二苯乙烯降血糖作用，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 雄性健康Wistar大鼠50只，體重220～230 g，購(gòu)于甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字14-008)；二苯乙烯，分子量：130.19，淺黃色透明液體，LD50：小鼠經(jīng)口1225 mg/kg，購(gòu)于英國(guó)Alfa Aesar公司；鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)購(gòu)于SIGMA公司；鹽酸二甲雙胍(metformin)緩釋片，購(gòu)于天津市津蘭藥業(yè)有限公司，實(shí)驗(yàn)時(shí)研末，用蒸餾水配制成所需濃度；脂肪乳，自制(豬油20%，蔗糖20%，食鹽2%，膽固醇2%，谷氨酸鈉1%，膽酸納1%，甲巰咪唑1%，丙二醇30 ml，加雙蒸水至100 ml)；全自動(dòng)生化分析儀(日立7600，日本株式會(huì)社生產(chǎn))；分光光度計(jì)(721B型，南京金牛高速分析儀器有限公司)。全部實(shí)驗(yàn)均在甘肅省證據(jù)科學(xué)技術(shù)研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(甘肅政法學(xué)院，SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，使用許可證號(hào)：SYXK(甘)2010-0002)完成。

1.2 2 型糖尿病模型的建立 50只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為模型組(n=40)和對(duì)照組(n=10)。全部大鼠在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室IVC飼育盒飼養(yǎng)，自由飲食進(jìn)水，明暗周期12 h，單籠飼養(yǎng)。動(dòng)物房溫度20℃～23℃，濕度55%～65%，適應(yīng)7 d。模型組口服脂肪乳20 ml/kg；對(duì)照組灌胃給予等量蒸餾水。每天1次，連續(xù)40 d。分別在第41、42天時(shí)模型組大鼠腹腔注射STZ 120 mg/kg、100 mg/kg，各1次。48 d后禁食12 h，不禁水，尾部采血，測(cè)空腹血糖和血脂值。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 模型組大鼠根據(jù)血脂、血糖值隨機(jī)分為：①A組(n=10)：灌胃二苯乙烯500 mg/kg；②B組(n=10)：灌胃二苯乙烯200 mg/kg；③C組(n=10)：灌胃二苯乙烯100 mg/kg；④D組(n=10)：灌胃二甲雙胍100 mg/kg。對(duì)照組(E組)灌胃等量蒸餾水。各組每天給藥1次，連續(xù)給藥20 d。

1.4 血糖和血脂水平的測(cè)定 所有大鼠給藥后第21天，禁食12 h，不禁水，從尾靜脈采血，用日立7600全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)空腹血糖(Glu)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)水平。

1.5 大鼠肝糖元含量的測(cè)定

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別取100 mg/L的葡萄糖溶液 0.05 ml、 0.1 ml、 0.2 ml、 0.3 ml、 0.4 ml、 0.6 ml、0.8 ml，用蒸餾水補(bǔ)足1 ml，將試管置于冰水浴中，再加入4 ml蒽酮試劑，加完后放入沸水煮沸10 min，立即取出迅速?zèng)_冷，室溫平衡10 min，721B型分光光度計(jì)在620 nm下測(cè)定吸光度A值，繪成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 肝臟糖元含量的測(cè)定 稱取肝臟500 mg，加5%的三氯乙酸液4 ml制成勻漿，3000 r/min離心5 min，取上清液1 ml加入4 ml蒽酮試劑，其余步驟同1.5.1項(xiàng)。用回歸方程計(jì)算樣品肝糖元含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件中Dunnett單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 2 型糖尿病模型的建立 給予脂肪乳和腹腔注射STZ后，模型組大鼠的Glu和TG、TC、LDL-C、HDL-C分別升高140.89%、25.77%、275.52%、105.54%和31.25%，與建模前比，差異具有顯著性意義(P＜0.01)，建模成功。見圖1。

圖1 建模前后大鼠血糖和血脂水平

2.2 二苯乙烯對(duì)模型大鼠肝糖元水平的影響 以葡萄糖溶液濃度及其吸光度A值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。

圖2 葡萄糖吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 二苯乙烯對(duì)大鼠血糖和血脂水平的影響

按標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.005x2+0.0061x+0.0179計(jì)算出每g肝組織糖元水平。給藥20 d后，A、B、C肝糖元水平比E組提高了8.06%～16.17%，且呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。結(jié)果提示，二苯乙烯能促進(jìn)肝臟合成肝糖元，從而降低血糖水平。而D組肝糖元水平明顯低于A、B、C組，略低于E組水平，提示，二甲雙胍降糖途徑可能與肝糖元合成關(guān)系不大。見表1。

2.3 二苯乙烯對(duì)血糖、血脂的調(diào)節(jié)作用 給藥后，模型組血糖和血脂水平比給藥前明顯降低(P＜0.05～0.01)。見表1。

3 討論

2型糖尿病的特點(diǎn)是以胰島素抵抗伴胰島素分泌相對(duì)不足為主要病理生理過(guò)程[6]。胰島素抵抗是指機(jī)體靶組織對(duì)胰島素的反應(yīng)性低于正常的一種病理生理狀態(tài)，主要表現(xiàn)為肝臟及其外周組織(肌肉、脂肪組織)對(duì)葡萄糖的攝取障礙及肝臟葡萄糖輸出增多，肝臟對(duì)葡萄糖攝取和利用均降低。肝臟糖的產(chǎn)生及肝糖輸出亦增加，血液中的葡萄糖無(wú)法正常進(jìn)入組織細(xì)胞被利用，因而使血糖升高最終導(dǎo)致糖尿病。

目前，很多學(xué)者采用不同的方法建立了糖尿病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[7-9]，陳秋等曾模仿機(jī)體胰島素耐受的發(fā)病機(jī)制及其病理學(xué)特點(diǎn)，用生理及超生理濃度的胰島素分別刺激HepG2細(xì)胞，采用高濃度胰島素體外誘導(dǎo)培養(yǎng)法建立與復(fù)制了一種呈胰島素耐受特點(diǎn)的HepG2細(xì)胞模型[10]。利用胰島素抵抗動(dòng)物模型和細(xì)胞模型進(jìn)行了大量的藥物有效成份篩選[11-14]。由于2型糖尿病是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，因此近年的研究中重視了飲食的重要性，尤其是高脂、高熱量的不合理的飲食結(jié)構(gòu)對(duì)代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展起著推動(dòng)作用。

本文采用脂肪乳和分次腹腔注射STZ后，大鼠的Glu和TG、TC、LDL-C、HDL-C分別升高140.89%、25.77%、275.52%、105.54%和31.25%，與建模前比，差異具有顯著性意義(P＜0.01)，建立的2型糖尿病模型表現(xiàn)出肥胖、高血糖伴有高血脂血癥及胰島素抵抗，與2型糖尿病的特征一致[15]。給予二苯乙烯500、200、100 mg/kg后20 d，模型組血糖和血脂水平比給藥前明顯降低(P=0.05～0.01)，二苯乙烯組肝糖元水平比對(duì)照組提高8.06%～16.17%，且呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。二甲雙胍組肝糖元水平明顯低于二苯乙烯組，略低于對(duì)照組水平，結(jié)果提示，二甲雙胍降糖途徑可能與肝糖元合成關(guān)系不大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，二苯乙烯能明顯降低2型糖尿病大鼠的血糖，改善糖尿病癥狀。其機(jī)制可能與二苯乙烯能促進(jìn)肝臟分解氧化血脂，合成肝糖元有關(guān)。

[1]Yang J,Wang N,Li J,et al.Effects of resveratrol on NO secretion stimulated by insulin and its dependence on SIRT1 in high glucose cultured endothelial cells[J].Endocr J,2010,37(2):365-372.

[2]Huang JP,Huang SS,Deng JY,et al.Insulin and resveratrol act synergistically,preventing cardiac dysfunction in diabetes,but the advantage of resveratrol in diabetics with acute heart attack is antagonized by insulin[J].Free Radic Biol Med,2010,49(11):1710-1721.

[3]Xue J,Ding W,Liu Y.Anti-diabetic effects of emodin involved in the activation of PPARgamma on high-fat diet-fed and low dose of streptozotocin-induced diabetic mice[J].Fitoterapia,2010,81(3):173-177.

[4]沈忠明,殷建偉,袁海波.虎杖鞣質(zhì)的降血糖作用研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2004,16(3):220-221.

[5]趙貴卿,吳祖澤,袁麗珍,等.二苯乙烯類化合物E1的降糖作用及其機(jī)制的初步研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2002,18(3):320-322.

[6]張鵬東,徐衛(wèi)國(guó).糖尿病與惡性腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展[J].臨床腫瘤學(xué)雜志,2008,13(9):856-859.

[7]Qiu LH,List EO,Kopchick JJ.Differentially expressed proteins in the pancreas of died-induced diabetic mice[J].Mol Cell Proteomics,2005,4(9):1311-1318.

[8]Liu Y,Wang ZB,Yin WD,et al.Severe insulin resistance and moderate glomerulosclerosis in a minipig model induced by high-fat/high-sucrose/high-cholesteroldied [J].Exp Anim,2007,56:11-20.

[9]艾靜,王寧,杜杰,等.Wistar大鼠2型糖尿病動(dòng)物模型的建立[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2004,20(11):1309-1312.

[10]陳秋,夏永鵬,邱宗蔭.吡格列酮對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型的藥理學(xué)評(píng)價(jià)[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2006,22(2):248-251.

[11]曾艷,賈正平,張汝學(xué),等.地黃寡糖在2型糖尿病大鼠模型上的降血糖作用及機(jī)制[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2006,22(4):411-415.

[12]俞發(fā)榮,楊青平,王瑞.復(fù)方天麥提取物調(diào)血糖作用及其毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)[J].甘肅科技縱橫,2005,34(6):204,190.

[13]俞發(fā)榮,連秀珍,郭紅云.天門冬提取物對(duì)血糖的調(diào)節(jié)[J].中國(guó)臨床康復(fù),2006,10(27):57-59.

[14]俞發(fā)榮,楊青平，連秀珍.天門冬提取物對(duì)糖尿病模型動(dòng)物胰島細(xì)胞形態(tài)和胰島素水平的影響[J].衛(wèi)生職業(yè)教育,2007,25(2):118-119.

[15]都健,趙玉巖,謝輝,等.喂養(yǎng)型胰島素抵抗動(dòng)物模型的建立與評(píng)價(jià)[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2002,31(5):343-346.