李 超，陳元坤，吳學(xué)淵，楊海涵

（四川省新獸藥工程技術(shù)研究中心，四川 成都 611130）

植物血凝素（PHA）是一種從豆科植物中提取的有絲分裂原，作為一種低聚糖與蛋白質(zhì)的復(fù)合物，植物血凝素有促進(jìn)淋巴細(xì)胞有絲分裂、激活免疫細(xì)胞的作用。本試驗研究了植物血凝素對仔豬免疫功能方面的影響，以進(jìn)一步證實其免疫增強(qiáng)功能。

1 試驗材料

1.1 試驗動物 品種相同、體重相近的未進(jìn)行豬瘟疫苗免疫的35日齡仔豬60頭，由成都乾坤動物藥業(yè)有限公司實驗豬場提供。

1.2 試驗藥品及試劑 豬瘟兔化弱毒疫苗（批號110205，大北農(nóng)公司），豬瘟病毒IgG抗體檢測試劑盒（批號2011.4.01，深圳綠詩源生物技術(shù)有限公司），動物淋巴細(xì)胞分離液SC1083（批號2011.1.12，北京五洲元業(yè)科貿(mào)公司）；α-醋酸萘酯、甲基綠、品紅、亞硝酸鈉（北京索萊寶科技有限公司）；雞子豆購自超市。

1.3 試驗儀器 JJ-2型高速組織搗碎勻漿機(jī)，XFB-200小型高速粉碎機(jī)，IMark 10608型酶標(biāo)儀，顯微鏡，離心機(jī)等。

2 試驗方法

2.1 植物血凝素（PHA）的制備 稱取雞子豆適量，粉碎，加入適量蒸餾水4℃冰箱放置，吸脹24 h，在高速組織搗碎勻漿機(jī)內(nèi)12000 r/min勻漿2次，每次5min，置4℃冰箱抽提24h。再用紗布過濾，濾渣棄掉，濾液以4800 r/min離心20min，收集上清液，進(jìn)行活性測定。

活性測定采用紅細(xì)胞凝集實驗。通過翅靜脈采集新鮮公雞血，用3.8%枸櫞酸鈉抗凝，3 000 r/min離心15min，去上清，收集沉淀的紅細(xì)胞，再用生理鹽水洗滌3次，最后用生理鹽水配成1%～2%紅細(xì)胞懸液。將PHA倍比稀釋成21～210等梯度，結(jié)果以使紅細(xì)胞凝集50%以上的PHA的最大稀釋倍數(shù)為血凝效價。測定血凝效價后加入適量甘露醇、蔗糖進(jìn)行真空冷凍，干燥，然后稱重，計算PHA凍干粉的重量。

2.2 豬瘟疫苗免疫 將60頭仔豬隨機(jī)分為4組，每組15頭，Ⅰ組為空白不注射藥物對照組，Ⅱ組為PHA低劑量組，Ⅲ組為中劑量組，Ⅳ組為高劑量組。試驗Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組每頭注射豬瘟疫苗2頭份，再分別注射PHA 凍干粉 7、14、70mg/kg，連續(xù)注射 PHA 3 d，每天1次；試驗Ⅰ組（對照組）每頭注射豬瘟疫苗2頭份后，再注射等體積生理鹽水為對照。免疫接種和注射藥物后，幾個組進(jìn)行相同的飼養(yǎng)管理。

2.3 血樣收集及豬瘟抗體測定 豬瘟疫苗免疫前1 d和免疫后15 d通過前腔靜脈采血7～8mL，取4mL血液用枸櫞酸鈉抗凝，用于血液淋巴細(xì)胞計數(shù)；其余的析出血清供豬瘟抗體測定用?？贵w測定方法參照試劑盒說明，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為：OD值＜0.2為抗體陰性，0.2＜OD值＜0.4為可疑，OD值＞0.4為抗體陽性。試驗數(shù)據(jù)用SPSS11.5統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行T檢驗，以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2.4 淋巴細(xì)胞計數(shù)

2.4.1 淋巴細(xì)胞分離 用等體積生理鹽水稀釋上述抗凝血液，取3mL淋巴細(xì)胞分離液加入離心管管底，并升溫到室溫，用加樣器吸取6mL稀釋后的血液樣品，沿管壁緩慢鋪到淋巴細(xì)胞分離液上面，勿打亂液層界面，室溫下2 000 r/min離心20min。離心后管底是紅細(xì)胞，中間層是分離液，最上層是血漿。血漿層與分離液之間是一薄層較致密的白膜，含單個核細(xì)胞（包括淋巴細(xì)胞和單核粒細(xì)胞），用吸管直接插入到單個核細(xì)胞層并吸取該層，放入另一試管中，再加入10mL生理鹽水稀釋，1 000 r/min離心 10min，棄上清。重復(fù)洗滌1～2次，除去血小板和抗凝物質(zhì)，最后用生理鹽水稀釋備用。

2.4.2 染色計數(shù) 應(yīng)用酸性α醋酸萘酯酶（ANAE）染色法進(jìn)行染色計數(shù)。方法：將淋巴細(xì)胞涂片，自然干燥后用2.5%戊二醛4℃下固定10min，然后用蒸餾水沖洗，自然干燥。于固定的標(biāo)本片上滴加染色液，以覆蓋為度，37℃染色45～60min，蒸餾水沖洗。再用甲基氯復(fù)染1～5min，蒸餾水沖洗，自然干燥，鏡檢。在胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不一、數(shù)量不等的黑紅色顆粒細(xì)胞即為T淋巴細(xì)胞，無此顆粒的為B淋巴細(xì)胞。同時計數(shù)淋巴細(xì)胞100～200個，求出它們各占的百分比。試驗數(shù)據(jù)用SPSS11.5統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行T檢驗，以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

3 試驗結(jié)果

3.1 PHA的制備 提取的PHA經(jīng)血凝活性測定效價為28，凍干后每瓶PHA重87mg。

3.2 豬瘟抗體測定結(jié)果 豬瘟抗體測定結(jié)果如表1所示。從表1可以看出，豬瘟疫苗免疫前各組的抗體水平均趨于陰性，抗體水平差異不顯著（P＞0.05）；免疫后15d，抗體均轉(zhuǎn)為陽性，抗體平均水平最高的為高劑量組，其次為中、低劑量組和對照組，其中高劑量組與對照組相比差異極顯著（P＜0.01），中、低劑量組和對照組相比，差異顯著（P＜0.05），而低、中、高劑量各組之間的差異不顯著（P＞0.05）。說明不同劑量的植物血凝素均可顯著增強(qiáng)豬瘟疫苗的免疫應(yīng)答，提高其抗體水平，并存在量效依賴關(guān)系。

3.3 淋巴細(xì)胞計數(shù)結(jié)果 淋巴細(xì)胞計數(shù)結(jié)果如表2所示。幾個組在豬瘟疫苗免疫前（未注射PHA前），其T淋巴細(xì)胞百分率差異不顯著（P＞0.05）；在免疫后（注射PHA后）15 d，低、中、高劑量組和對照組相比，其T淋巴細(xì)胞百分率均顯著提高（P＜0.05），以高劑量組的T淋巴細(xì)胞百分率最高，而低、中、高劑量組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。說明植物血凝素能顯著提高T淋巴細(xì)胞的百分率，有促進(jìn)T細(xì)胞分化增殖的作用，且與PHA用藥劑量呈正相關(guān)。

4 討論

植物血凝素主要用于激活免疫細(xì)胞——淋巴細(xì)胞，是一種干擾素誘導(dǎo)劑，不僅可以刺激機(jī)體產(chǎn)生白介素-2和干擾素，還可以刺激機(jī)體產(chǎn)生非特異性抗體。植物血凝素與黃芪多糖等多種中草藥聯(lián)用具有增效作用，與部分抗生素聯(lián)用具有相加作用。因其強(qiáng)大的增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫力的作用以及抗病毒作用，植物血凝素在獸藥中的應(yīng)用已日益廣泛。本研究表明，植物血凝素能顯著增強(qiáng)豬瘟疫苗免疫后的抗體水平，顯著提高T淋巴細(xì)胞的百分率，并存在量效依賴關(guān)系。

表1 豬瘟疫苗免疫前后抗體OD值

表2 淋巴細(xì)胞計數(shù)結(jié)果

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