閻紅娥,姜文玉,鮑文華,王春玲

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科,黑龍江 佳木斯 154003)

惡性腫瘤的發(fā)生不僅與腫瘤細(xì)胞的異常增殖及分化有關(guān),而且與細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)紊亂所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡受抑制也有關(guān),凋亡通路的紊亂、凋亡因子的抑制、凋亡因子的過表達(dá)以及凋亡基因的表達(dá)失控都會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。成為惡性腫瘤形成的重要機(jī)制之一。Livin是新近發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族成員之一,特異性表達(dá)于人的胚胎組織及大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞,如黑色素瘤、白血病、前列腺癌及膀胱癌等,其在正常成人組織中低或無表達(dá),提示該基因在腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡過程起著重要作用[1～4]。核因子 - κB(nuclear factor kappa B,N F- κ B)是1986年 Sen等[5]首先從成熟 B淋巴細(xì)胞核抽取物中檢出的,可與免疫球蛋白 k鏈基因的增強(qiáng)子序列特異性結(jié)合并促使 k鏈基因轉(zhuǎn)錄的核蛋白因子,其廣泛存在于真核細(xì)胞,是一種具有多向調(diào)節(jié)功能的轉(zhuǎn)錄因子,主要通過啟動(dòng)和調(diào)節(jié)多種腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及轉(zhuǎn)移,目前的研究認(rèn)為它與炎癥、免疫反應(yīng)、創(chuàng)傷、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡以及胚胎發(fā)育等重要事件有著密切聯(lián)系。N F-κ Bp65是它的活性成分,調(diào)控一系列基因的表達(dá)。本文旨在運(yùn)用免疫組化方法測(cè)定非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織中 Livin、NF-κBp65的表達(dá)及在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其相互之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

隨機(jī)選取佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 2009— 02～ 2011—02手術(shù)切除 NSCLC組織標(biāo)本40例,其中鱗癌 30例,腺癌10例;高、中分化29例,低分化11例;按 UICC1997肺癌分期標(biāo)準(zhǔn)分期 ,Ⅰ 、Ⅱ 期 27例 ,Ⅲ 期 13例 ;男 25例 ,女 15例;有淋巴 結(jié)轉(zhuǎn)移的21例 ,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的19例;均為原發(fā)性肺癌,且術(shù)前未接受放化療,取10例癌旁正常肺組織作為對(duì)照。

1.2 試劑

Livin多克隆抗體(bs-0738R)、N F-κBp65兔抗人單克隆抗體(bs-0465R)均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,SP免疫組織化試劑盒(KIT-9710)和 DAB顯色試劑盒(DAB-0031)均購自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

肺癌標(biāo)本經(jīng)福爾馬林液固定、常規(guī)石蠟包埋。每例連續(xù)切片 3張 ,切片厚 4 μm,供常規(guī) HE染色和 Livin、NF-κBp65免疫組織化學(xué)染色。Livin多克隆抗體濃度為1：500,N F-κBp65兔抗人多克隆抗體濃度為1：500。參照檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

兩種蛋白染色陽性均為棕黃色,均表達(dá)于細(xì)胞漿。在10× 40高倍視野下,隨機(jī)選 10個(gè)視野 ,計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞中陽性比例計(jì)算百分率,陽性細(xì)胞 ＜10%記為(-);陽性細(xì)胞數(shù)在10%～ 25%記為 (+);陽性細(xì)胞數(shù)在 25%～50%記為(++);陽性細(xì)胞數(shù)＞ 50%記為(+++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用i2檢驗(yàn)和 Spearman等級(jí)相關(guān)分析,P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織中 Livin、NF- κ Bp65的表達(dá)

在 40例 N SCLC組織中,31例癌細(xì)胞 Livin呈陽性 [(+ )～ (+++)]表達(dá),陽性率為77.5%;26例癌細(xì)胞 NF-kBp65呈陽性 [(+)～ (+++ )]表達(dá),陽性率為65%。15例癌旁正常肺組織 Livin、NF-κ Bp65陽性率分別為 16.7%、26.5%。Livin和 NF-κBp65陽性均表達(dá)于癌細(xì)胞胞漿中,為棕黃色,間質(zhì)和血管均未見表達(dá) (見圖1～ 4)。

圖4 N F- κ Bp65在肺腺癌細(xì)胞中表達(dá)(SP×200)

2.2 肺癌組織中 livin、NF-kBp65的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

Livin的表達(dá)水平與肺癌的病理類型、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P ＜0.05)相關(guān),與患者的性別、年齡、腫瘤直徑、TNM分期、分化程度無明顯相關(guān)性 (P＞ 0.05)。NF-κBp65的表達(dá)水平與肺癌分化程度、TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P ＜0.05),與患者的性別、年齡、病理類型、腫瘤直徑無明顯相關(guān)性 (P＞ 0.05),見表1。

表1 肺癌組織中 Livin、N F- κ Bp65的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

3 討論

Livin是2000年 Lin等[1]根據(jù) IAPs基因同源序列,在人的胎腎 cDN A文庫中發(fā)現(xiàn)的新成員,當(dāng)時(shí)將其命名為 KIAP(Kidney inhibitor of apoptosis protein);2001年 Kasof等[2]將之命名為 Livin并沿用至今。Livin位于染色體 20q13,全長(zhǎng)46kb,Livin蛋白 N端僅包含一個(gè)桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復(fù)序列 BIR結(jié)構(gòu),C端含一個(gè) R ING環(huán)指結(jié)構(gòu),由于剪接方式不同分為兩種亞型,Livin a及 Livinβ。其表達(dá)分布又有不同,β亞型表達(dá)主要存在于胎兒腎臟組織中,而α亞型在其中尚未發(fā)現(xiàn)表達(dá)。在正常成人的大腦、骨骼肌、外周血淋巴細(xì)胞中可發(fā)現(xiàn)α亞型的表達(dá),但表達(dá)水平較低。

本研究顯示,Livin蛋白在 NSCLC組織中的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁肺組織,提示 Livin在肺癌發(fā)生中起一定作用;腺癌高于鱗癌、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者,與陳曉等[6]的報(bào)道一致,提示 Livin可能在腫瘤的轉(zhuǎn)移中起作用;Livin表達(dá)與肺癌 TNM分期無關(guān),與陳曉等[6]的報(bào)道不同,可能與該實(shí)驗(yàn)樣本較少及標(biāo)本選擇有關(guān),有待于以后大樣本中繼續(xù)研究。本實(shí)驗(yàn)表明 Livin與肺癌組織學(xué)類型、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移相關(guān),與瘤體大小、患者年齡、TNM分期無明顯相關(guān)性,可能成為肺癌檢測(cè)及治療的新靶點(diǎn)。

N F-κ B是一種核轉(zhuǎn)錄因子,通常和抑制蛋白 IKB組成無活性的 N F-κ B/IKB三聚體形式,在一些因素刺激下 IKB發(fā)生磷酸化后降解[7],從而使 N F-κ B被激活,當(dāng)細(xì)胞受生長(zhǎng)因子、白介素1(IL-1)、致癌物等的刺激時(shí),IKB泛素化繼而被蛋白酶水解,活化的 P65進(jìn)入細(xì)胞核,與κB結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。本研究結(jié)果顯示,在正常肺組織中 ,NF-κBp65陽性表達(dá)率明顯弱于腫瘤組織,說明在非腫瘤組織中 N F-κBp65處于不斷的激活和失活的有序調(diào)控中,而在腫瘤組織中 N F-κ Bp65失去控制而被過度激活,從而導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖,進(jìn)而引起腫瘤的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 NF-κ Bp65在低分化 NSCLC組織中的陽性表達(dá)率明顯高于中、高分化肺癌組織,提示 N F-κBp65的高表達(dá)與 NSCLC的惡性程度密切相關(guān)。有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組 N F-κBp65表達(dá)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,也提示了 N F-κBp65過度活化與 N SCLC的侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān),N F-κBp65高表達(dá)促進(jìn)了 N SCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果表明,NF-κ Bp65表達(dá)與病人性別、年齡、組織學(xué)類型無明顯相關(guān)性,而與瘤體大小分、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

Livin是目前唯一一個(gè)證實(shí)能夠直接與 Caspase-3結(jié)合的蛋白,通過 BIR結(jié)構(gòu)域直接抑制 Caspase-3發(fā)揮抗凋亡的作用。Kasof等[1]研究認(rèn)為 Livin通過 BIR結(jié)構(gòu)域可與介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的下游的效應(yīng) Caspase(Caspase-3和 Caspase-7)結(jié)合,抑制其活性。最近有學(xué)者[8]發(fā)現(xiàn) livin主要通過 caspase活性參與腫瘤壞死因子(TN F)介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子 NF-κ B的激活從而發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)。同時(shí)一些研究表明,NF-κ B也具有抗凋亡的作用,其抗凋亡作用可能通過上調(diào)編碼抗凋亡的因子。因此二者之間存在某種相關(guān)性,共同促進(jìn)腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。本試驗(yàn)通過對(duì)非小細(xì)胞肺癌組織中 livin與 NF-κ Bp65的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)分析 ,證實(shí) Livin在NSCLC組織中陽性率為77.5%,livin高表達(dá)與肺癌分化程度相關(guān) (P＜0.05),同時(shí) NF-κBp65在 NSCLC組織中陽性率為65%,NF-κBp65的高表達(dá)與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P＜0.05),Livin和 N F-κ Bp65表達(dá)具呈顯著正相關(guān)(r= 0.265,P ＜0.05)。綜上所述 ,我們的研究提示 N F-κBp65可能通過上調(diào) Livin的表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡 ,從而增加腫瘤細(xì)胞的增殖,成為其促進(jìn)肺癌發(fā)生發(fā)展的可能途徑之一。

[1] Kasof GM,Gomes BC.Livin,a novel in hibitor of apoptosis protein family member[J].J Biol Chem,2001,276(5):3238-3246

[2] L in JH,Deng G,Huang Q,et al.KIAP,a novelm ember of the inhibitor of apoptosis protein family[J].Biochem and Biophys Com,2000,279:820-831

[3] Vucic D,Stennicke HR,Pisabarro M T,et al.ML- IAP,a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expresses in hum an melanom as[J].Current Biol,2000,10:1359-1366

[4] Ashhab Y,Alian A,Polliack A,et al.Two splicing variants of a new inhibitor of apoptosis gene with different biological properties and tissued istribution pattern[J].Mol Cell,2003,11(3):551-552

[5] Sen R,Baltimore D.Multiple nuclear factors interact with the immuno globulin enhancer sequences[J].Cell,1986,46(5):705-716

[6] 陳曉,楊春鹿,趙君.非小細(xì)胞肺癌組織中 Livin和 Smac蛋白表達(dá)及其臨床意義的研究 [J].中華腫瘤防治雜志,2008,15(12):905-909

[7] Laurence J,Murat T.NF- B signaling pros and cons of altering NF-κ B as a therapeutic approach[J].Ann N Y Acad Sci,2006,1072:114-122

[8] Wang Q,Wang X,Evers BM.Induction of c IAP22 in human colon cancer cells through PKC delta/N F2kappa B[J].J Biol Chem,2003,278(51):51091-51099