西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 (西安 710061)賀 學(xué) 盛業(yè)萌 劉恩岐

在高原中,大氣壓中氧分壓降低,引起缺氧環(huán)境,從而引發(fā)高原不適癥狀。長(zhǎng)期生活在高原環(huán)境中的生物,發(fā)生生理性適應(yīng)和生物適應(yīng),針對(duì)低氧環(huán)境,機(jī)體建立了一系列代謝補(bǔ)償機(jī)制,以更好的適應(yīng)高原環(huán)境。細(xì)胞的正常代謝和生存需要氧的參與,在高原低氧環(huán)境下,機(jī)體通過(guò)增加氧的傳遞,加快血液循環(huán)或激活不需要氧的代謝旁路,來(lái)維持機(jī)體保持正常的生理狀態(tài)[1,2]。研究發(fā)現(xiàn),在高原地區(qū),低氧環(huán)境改變了當(dāng)?shù)鼐用竦男难芟到y(tǒng)功能,使他們的心血管系統(tǒng)發(fā)生了適應(yīng)性的改變。心肌正常代謝所需要的氧氣和物質(zhì)主要通過(guò)心肌毛細(xì)血管的運(yùn)輸來(lái)完成,因此,心肌毛細(xì)血管的數(shù)量嚴(yán)重影響心臟的代謝過(guò)程。研究證實(shí)血管內(nèi)成因子 (Vascular endothelial grow thfactor,VEGF)和CD34在血管的生成中發(fā)揮著重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)在低氧環(huán)境中大鼠心臟 VEGF和 CD34的表達(dá)變化,為揭示低氧對(duì)心肌血管生成的作用提供依據(jù)。

材料與方法

1 動(dòng)物及分組 雄性健康的 Sprague-Dawley大鼠 60只,體重約為 220g,由交大醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為四組,分別為正常組,低氧 2周組,低氧4周組,低氧 6周組。除正常組外 ,其余各組大鼠置于模擬海拔 4000m的低壓氧艙內(nèi)飼養(yǎng),正常組與低氧組飼養(yǎng)的溫度,濕度,光照相同。

2 主要儀器和試劑 低壓氧艙(第四軍醫(yī)大學(xué)),核酸蛋白定量?jī)x (Eppendorf公司),PCR擴(kuò)增儀(Takara公司 ),電泳儀、轉(zhuǎn)膜等 (Bio-Rad公司),凝膠成像系統(tǒng)(UVP公司);引物合成(北京奧科),RNA提取、RT-PCR試劑盒(Takara公司),蛋白提取試劑盒(roche公司 ),CD34、VEGF抗體 (Santa公司 )。

3 病理學(xué)觀察 取每組大鼠 5只,斷頭處死,剖腹取右心室,剪去心房組織,置于 4℃生理鹽水中沖洗血液,然后放置在 10%的福爾馬林溶液中固定 24小時(shí)以上,最后進(jìn)行脫水,石蠟包埋,切片,HE染色,顯微鏡下觀察拍照。

4 CD34、V EGF mRN A表達(dá)的檢測(cè) 將保存于液氮中的心肌樣本置于研缽中,加入液氮進(jìn)行研磨,按照 RNAi plus的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總 RNA的提取。利用核酸蛋白定量?jī)x檢測(cè)提取的 RNA純度,測(cè)定RNA濃度。依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū),取 RNA溶液1 μ l,在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成 cDNA。 然后以 cDNA為模板,對(duì)目的基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR,檢測(cè)目的基因的表達(dá)量的變化。引物序列 β-actin上游:5′-CGT TGACATCCGT AAAGACCTC-3′, 下 游:5′-T AGGAGCCAGGGCAGT AATCT-3′;CD 34上 游:5′-CCTGCCGTCTGTCAATGT T TC-3′, 下 游:5′-GCACTCCTCGGATTCCT GAAC-3′;VEGF 上 游:5′-TGTGAGCCTT GTTCAGAGCG-3′, 下 游: 5′-GACGGTGACGATGGTGGTGT-3′。 PCR條 件 為:95℃預(yù)變性 10s,95℃ 5s,60℃ 30s,40個(gè)循環(huán)。以目的基因與內(nèi)參的熒光強(qiáng)度比值作為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

5 免疫印跡 (Western blot)檢測(cè) CD34、V EGF的表達(dá) 取液氮保存的心肌樣本,在冰上解凍后,用剪刀剪碎,繼而加入含蛋白酶抑制劑細(xì)胞裂解液,在低溫下進(jìn)行研磨,待研磨充分后,在冰上放置 20min,充分裂解后,在低溫冷凍離心機(jī)上高速離心,12000rpm,20min,取上清,保留檢測(cè)部分,其余-80℃保存。用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度,然后進(jìn)行 SDSPAGE電泳,電壓 120V,時(shí)間 2h。 Bio-Rad濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜槽,200mA恒流轉(zhuǎn)印 90min至 PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h,加一抗 4℃孵育過(guò)夜,加辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記二抗,室溫孵育 2 h,在凝膠成像系統(tǒng)上顯色,圖像采集。

結(jié) 果

1 病理學(xué)觀察:結(jié)果(圖 1)顯示,與正常對(duì)照組相比,低氧組大鼠心肌細(xì)變得肥大,細(xì)胞出現(xiàn)纖維化現(xiàn)象,隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng),這種現(xiàn)象愈發(fā)明顯。

2 低氧對(duì)大鼠右心室 CD34、VEGF mRNA表達(dá)的影響 (圖 2):對(duì)照組、低氧 2、4、6周組心臟右心室CD34mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為 8.3× 10-5、9.0×10-5、 9.6× 10-5、2.1× 10-4(圖 2上 ),V EGF的表達(dá)量 分別為 8.1× 10-4、 1.8× 10-3、3.0× 10-3、5.5×10-3(圖 2下)?？梢?jiàn)低氧 6周組 CD34和VEGF的表達(dá)量顯著的高于正常組,其中 VEGF的升高最為明顯。

圖1 病理學(xué)結(jié)果(A、B、C、D分別為正常、低氧 2、4、6周組)

圖2 CD34、V EGF mRN A在心肌組織中的相對(duì)表達(dá)量

圖3 CD34、V EGF蛋白在心肌組織中的相對(duì)表達(dá)量

3 低氧對(duì)大鼠右心室 CD34、VEGF蛋白表達(dá)水平的影響(圖 3):圖中從左到右對(duì)照組、低氧 2、4、6周組心臟右心室 CD34的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為:0.14、0.22、 0.31、0.48;VEGF的相對(duì)表達(dá)量分別為:0.18、0.27、0.39、0.56。 從數(shù)據(jù)能夠得出在低氧組,CD34和VEGF的表達(dá)量都明顯高于正常對(duì)照組。

討 論

氧是維持生存的必要因素,機(jī)體進(jìn)行各種新陳代謝都是在氧的參與下進(jìn)行的。低大氣壓,低氧分壓,缺氧程度大等是高原環(huán)境的特點(diǎn),嚴(yán)重影響動(dòng)植物的生存與發(fā)展,許多疾病的發(fā)生都是由于缺氧引起的。長(zhǎng)期生活在高原低氧環(huán)境下的生物,其某些組織結(jié)構(gòu)和生理機(jī)能發(fā)生了適應(yīng)性的變化,以更好的適應(yīng)高原低氧環(huán)境。動(dòng)物對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制研究已取得一定進(jìn)展,他們發(fā)現(xiàn)高原動(dòng)物的紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白含量明顯比生活在平原地區(qū)的高;許多高原生物肺泡數(shù)目多,體積小,單位面積肺血管數(shù)目增多,從而有助于吸取更多的氧氣,同時(shí)減緩肺動(dòng)脈壓力的升高[3];有些高原生物的血紅蛋白發(fā)生突變,與氧氣的結(jié)合能力更高,從而適應(yīng)高原低氧環(huán)境;生物體還通過(guò)調(diào)節(jié) NO的產(chǎn)生量,利用低氧誘導(dǎo)因子的調(diào)節(jié)等來(lái)適應(yīng)低氧環(huán)境[4]。

CD34選擇性地表達(dá)于造血干 /祖細(xì)胞膜上,是一種高度糖基化的跨膜蛋白,同時(shí)該因子也在血管內(nèi)皮細(xì)胞及其它組織中表達(dá)。CD34在造血祖細(xì)胞表達(dá)最高,但是隨著細(xì)胞分化、成熟,CD34抗體的表達(dá)逐漸減少,甚至消失[5,6]。可見(jiàn) CD34與血管的生成密切相關(guān),在新生血管中的表達(dá)十分明顯。Fujimoto等研究表明,對(duì)造血干 /祖細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),CD34+細(xì)胞在總細(xì)胞中所占的比例呈下降趨勢(shì)[7]。宋克東等人研究發(fā)現(xiàn)在低氧環(huán)境培養(yǎng)中,CD34+細(xì)胞在總細(xì)胞中所占比例呈上升趨勢(shì),擴(kuò)增倍數(shù)明顯提高[8]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在低氧環(huán)境中,CD34在心肌中的表達(dá)明顯提高,可能作為一種保護(hù)機(jī)制,促進(jìn)新生血管的產(chǎn)生,滿(mǎn)足心肌細(xì)胞對(duì)氧氣等的需求。

作為一種細(xì)胞因子,VEGF是一種分子量為 46 KD的二聚體多肽,廣泛存在于動(dòng)物組織中。V EGF以?xún)?nèi)皮細(xì)胞為特異性靶細(xì)胞,能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂,增加血管通透性、降低血管張力等多種功能[9]。有研究表明,相對(duì)與正常環(huán)境,低氧能夠誘導(dǎo)VEGF基因的表達(dá),促進(jìn)毛細(xì)血管的生成,增強(qiáng)血液為組織提供氧氣的效率,從而提高動(dòng)物對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)能力[10,11]。王雪蓮等人的研究表明在高原低氧環(huán)境下,在低氧誘導(dǎo)因子作用下,VEGF的表達(dá)明顯提高,通過(guò)促進(jìn)新生血管的生成來(lái)適應(yīng)高原環(huán)境[12]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與他們的一致。由于低氧環(huán)境的作用,在大鼠心肌組織中,VEGF的表達(dá)在 mRNA水平和蛋白水平都顯著增高,

綜上所述,通過(guò)研究在低氧環(huán)境下 SD大鼠心肌組織中 CD34和 VEGF的表達(dá)變化,闡述了 CD34和VEGF對(duì)大鼠適應(yīng)低氧條件所起的作用,為進(jìn)一步揭示生物對(duì)高原低氧環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制提供參考,為探索高原缺氧的高原醫(yī)學(xué)提供一定的理論依據(jù),推動(dòng)高原醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

[1]劉 忠,李文華.高原低氧環(huán)境下大鼠 RAAS水平及ACE2表達(dá)變化 [J].中國(guó)公共衛(wèi)生,2011,27(3):299-301.

[2]馬 嶺,馬福海.久居和世居高原成年人心血管系統(tǒng)功能的研究 [J].青海師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2006,28(3):104-106.

[3]Heath D,Edw ards C.The pulm on ary art eries of the yak[J].Cardio Res,1984,18(3):133-39.

[4]韓樹(shù)鑫,茍 瀟,楊舒黎.動(dòng)物低氧適應(yīng)的生理與分子機(jī)制[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2010,37(8):29-33.

[5]Jeziorska M,Woolley D.Neovascularization in early atherosclerotic lesions of human carotid arteries: Its potential contribution to plaque development[J].Hum Pathol,2005,30(8):919-925.

[6]Koshelev B,Trasovao S,Storozhe Y,et al.Changes in the systemic hemodynamics and the vascularbed of the skeletal muscles in rats adapted to hypoxia[J]. Hyp Med,2005,(2):6-19.

[7]Fujimoto N,Fujita S,Tsuji T,et al.Microencapsulated feeder cells as a source of soluble factors for expansion of CD34(+)hematopoietic stem cells[J].Biomaterials,2007,28(32):4795-4805.

[8]宋克東,劉天慶,趙國(guó)峰,等.低氧環(huán)境中微囊化成骨細(xì)胞支持造血干 /祖細(xì)胞擴(kuò)增[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2010,37(7):754-761.

[9]Yamazaki Y,MoritaT.M olecularand functional diversity of vascular endothelial growth factors[J].Mol Divers 2006,10(14):515-527.

[10]Pichiule P,Laanna JC.Angiopoietin-2and rat brain capillary remodeling during adaptation and deadaptation to prolonged mild hypoxia[J].J Appl Physiol,2002,93(3):1131-1139.

[11]Avivi A,Resnick M B,NevoE.Adaptivehypoxic tolerance in the subterranean mole rat spalax ehrenbergi:the role of vascular endothelial growth factor[J].FEBS Lett,1999,452(3):133-140.

[12]王雪蓮,李占全,冀林華.HIF-1α、V EGF在慢性高原低氧環(huán)境下 SD大鼠骨髓、心臟中的表達(dá)及意義 [J].山東醫(yī)藥,2009,49(9):34-35.