臘貴曉，劉國順，楊俞娟

(1.河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院，河南 鄭州 450002;2.浙江大學環(huán)境與資源學院，浙江 杭州 310029)

芥子油苷(Glucosinolates，GSs)，也稱硫代葡萄糖苷，是十字花科植物重要的次生代謝物質(zhì).近年來，由于在抗癌、防癌方面的特殊功效，芥子油苷研究成為流行病學、食品科學、農(nóng)業(yè)等多個領(lǐng)域的研究熱點［1］.國際癌癥基金會指出，每天食用10 g左右富含芥子油苷的蔬菜即可有效的預防癌癥的發(fā)生［2，3］.然而由于人們生活節(jié)奏的加快和膳食中蔬菜比例的下降［4］，芥子油苷攝入量嚴重不足.選取富含芥子油苷的蔬菜種類或者蔬菜組織成為從飲食角度增加芥子油苷攝入量最有效的途徑.芥藍是中國特有的蕓薹屬蔬菜，以菜薹為食用部位，其菜薹中芥子油苷種類和含量與國際公認的抗癌蔬菜—青花菜相當［5］，被認為是最有潛力的抗癌蔬菜之一［6］.研究表明，芥子油苷種類和含量在同一植株中，也因組織部位的不同而各異［7］.通常芥藍菜薹的定位是從底部膨大部位到頂端［8］，包含多個節(jié)間，但是很少就芥藍菜薹不同節(jié)間的芥子油苷種類及含量進行研究.了解芥藍菜薹不同節(jié)間芥子油苷的種類和含量對于指導人們?nèi)粘ｏ嬍持羞x取更有益于人類健康的蔬菜組織具有十分重要的意義.為此，本研究選取‘中花’、澄海粗條’和‘全年油青’3個芥藍品種為材料，對芥藍菜薹不同節(jié)間芥子油苷的種類和含量進行研究，以期為人們?nèi)粘ｏ嬍持羞x擇富含芥子油苷的組織器官，充分發(fā)揮芥子油苷的抗癌特性提供事實依據(jù).

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器 高效液相色譜儀(Waters1525 Waters公司，USA);液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 1100 LC/MSD，Agilent公司，USA);低溫冷凍干燥機(ALPHA 1-4，Christ公司，德國);高速冷凍離心機(Biofuge Stratos，Heraeus公司，德國)

1.1.2 主要試劑 DEAE-Sephadex A-25、2-丙烯基芥子油苷(Sinigrin)和硫酸酯酶(Sulphatase)購于 Sigma公司;乙腈為色譜純(Honeywell公司，USA);水為超純水(Millipore公司，USA)

1.2 芥藍栽培與樣品處理

試驗在浙江大學試驗農(nóng)場溫室進行，共選取具有代表性的3個芥藍品種，即‘中花’(ZH)、‘澄海粗條’(CHCT)和‘全年油青’(QNYQ).選取子粒飽滿的芥藍種子，經(jīng)催芽后在蛭石中育苗.待3葉1心時移栽到裝滿蛭石的盆子中培養(yǎng).每3 d澆灌1次霍格蘭營養(yǎng)液.待菜薹充分生長、未開花時，從膨大處取生長健壯、無病蟲害的芥藍菜薹，用剪子從底部菜薹膨大處到頂端將菜薹平均分為4節(jié)(標記為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ)，迅速放入冰盒中帶回實驗室.菜薹經(jīng)-80℃冷凍后，真空冷凍干燥，磨粉后置于干燥器中，貯存于-20℃冰箱待用.

1.3 芥子油苷的提純及脫硫

稱取0.10 g凍干樣品，加入1.5 mL體積分數(shù)70%甲醇，在70℃的水浴鍋中提取10 min，然后4 000 r·min-1離心10 min.沉淀再按照上述方法提取2次，合并上述提取液，定容到5 mL.同時做2個平行.取3 mL提取液流經(jīng)DEAE Sephadex A-25萃取柱，待提取液全部流出小柱后，加入100 μL硫酸酯酶溶液(28.4個單位).室溫反應(yīng)18 h后用4×0.5 mL 超純水洗脫.洗脫液過 0.45 μm 微膜后-20 ℃ 冰箱保存，待 HPLC 分析［9，10］.利用 2- 丙烯基芥子油苷(Sinigrin)作為外標進行定量.

1.4 液相色譜/質(zhì)譜條件

1.4.1 HPLC 分離條件［11］色譜柱為 Prontosil ODS2 C18 柱(250 mm ×4.6 mm，粒徑5 μm);流動相:超純水和乙腈體系，梯度條件:0～20 min，乙腈梯度變化:0～20%;20～30 min，乙腈體積分數(shù)保持20%.柱溫35℃，進樣量50 μL，檢測波長227 nm，流速 1.0 mL·min-1.

1.4.2 MS鑒定條件 采用 LC-ESI/MS鑒定，鑒定過程根據(jù) MATTH?US和 LUFTMANN 報道［3］的特征離子方法進行，數(shù)據(jù)由Agilent 1100 LC/MSD化學工作站采集.質(zhì)譜條件如下:離子源:電噴霧電離源(ESI);離子極性:正離子(positive);噴霧器壓力(nebulizer pressure):60 psi;干燥氣(N2)流速(drying gas flow):13 L·min-1;干燥氣溫度(drying gas temperature):350℃;毛細管電壓(capillary voltage):4 000 V;碎片電壓(fragmentor):100 V;掃描離子范圍:m/z 100.00 ～600.00.

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理及圖表繪制利用Word和Excel進行，統(tǒng)計分析應(yīng)用 DPS 7.05 軟件進行［12］.

2 結(jié)果與分析

2.1 芥藍菜薹不同節(jié)間芥子油苷組分及總含量

芥藍菜薹中典型的芥子油苷色譜圖如圖1所示.圖1表明，在芥藍菜薹典型樣品中，共測到11種芥子油苷，其中3-甲基亞硫酰丙基芥子油苷、2-羥基-3-丁烯基芥子油苷、2-丙烯基芥子油苷、4-甲基亞硫酰丁基芥子油苷、5-甲基亞硫酰戊基芥子油苷、3-丁烯基芥子油苷和4-甲硫基丁基芥子油苷7種芥子油苷來源于甲硫氨酸，屬于脂肪族芥子油苷.而4-羥基-3-甲基吲哚芥子油苷、3-吲哚甲基芥子油苷、4-甲氧基-3-吲哚甲基芥子油苷和1-甲氧基-3-吲哚甲基芥子油苷來源于色氨酸，屬于吲哚族芥子油苷.

3個芥藍品種菜薹不同節(jié)間芥子油苷含量見圖2.由圖2可以看出，在3個芥藍品種菜薹中，以澄海粗條第4節(jié)總芥子油苷含量最高，含量(DW)達到8.15 μmol·g-1，全年油青第 1 節(jié)含量最低，含量(DW)僅為 0.75 μmol·g-1.從圖 2 還可以看出，在3個芥藍品種菜薹中，總芥子油苷均以菜薹第4節(jié)中含量最高，顯著高于其它3個節(jié)間，菜薹其它3個節(jié)間總芥子油苷含量差異均不顯著.

2.2 芥藍菜薹不同節(jié)間脂肪族芥子油苷組分及含量分析

2.2.1 芥藍菜薹不同節(jié)間脂肪族芥子油苷各組分及含量 各脂肪族芥子油苷組分含量見表1.從表1可以看出，除在全年油青第1節(jié)中沒有檢測到4-甲硫基丁基芥子油苷外，在3個芥藍品種的其它節(jié)間均檢測到7種脂肪族芥子油苷.在3個芥藍品種菜薹的脂肪族芥子油苷中，均以3-丁烯基芥子油苷含量最高，而含量最低的脂肪族芥子油苷在不同品種和菜薹不同節(jié)間不同，除在中花菜薹第1節(jié)中為4-甲硫基丁基芥子油苷和第2節(jié)與第4節(jié)中為2-羥基-3-丁烯基芥子油苷外，其它各品種菜薹各節(jié)間中含量最低的均為5-甲基亞硫酰戊基芥子油苷.

從表1還可以看出，不同種類的脂肪族芥子油苷在芥藍菜薹不同節(jié)間的變化趨勢不一致.3-甲基亞硫酰丙基芥子油苷、4-甲基亞硫酰丁基芥子油苷和3-丁烯基芥子油苷含量均在3個芥藍品種菜薹的第4節(jié)含量達到最大值，在第1節(jié)中含量最低.2-羥基-3-丁烯基芥子油苷和2-丙烯基芥子油苷在中花菜薹4個節(jié)間均無顯著差異，而在澄海粗條和全年油青菜薹的第4節(jié)中含量最高，顯著高于前3節(jié).5-甲基亞硫酰戊基芥子油苷含量在中花和全年油青菜薹的4個節(jié)間含量差異不顯著，而在澄海粗條菜薹中，在第1節(jié)和第4節(jié)中含量最高，顯著高于第2節(jié)和第3節(jié)的含量，但是第1節(jié)和第4節(jié)之間、第2節(jié)和第3節(jié)之間差異不顯著.4-甲硫基芥子油苷除在全年油青的第1節(jié)中沒有檢測到外，在3個芥藍品種菜薹中均以第3節(jié)含量最高.

2.2.2 芥藍菜薹不同節(jié)間總脂肪族芥子油苷含量的差異 從圖3可以看出，在3個芥藍品種中，總脂肪族芥子油苷含量均以菜薹第4節(jié)中含量最高，顯著高于其它3個節(jié)間;在菜薹其它的3個節(jié)間，除在中花的第3節(jié)中脂肪族芥子油苷含量顯著高于第1節(jié)外，在其它2個芥藍品種中，菜薹3個節(jié)間脂肪族芥子油苷含量差異并不顯著.

表1 芥藍菜薹不同節(jié)間各脂肪族芥子油苷組分及含量Table 1 Individual aliphatic GS in different sections of bolting stems in Chinese kale

圖3 芥藍菜薹不同節(jié)間總脂肪族芥子油苷含量Fig.3 Total aliphatic GS content in different sections of bolting stems in Chinese kale

2.3 芥藍菜薹不同節(jié)間吲哚族芥子油苷組分及含量

2.3.1 芥藍菜薹不同節(jié)間吲哚族芥子油苷各組分及含量 除在全年油青菜薹的第1節(jié)和第2節(jié)中沒有檢測到4-羥基-3-吲哚甲基芥子油苷外，在其它芥藍品種菜薹的節(jié)間均檢測到4種吲哚族芥子油苷(見表2).在中花中，除在菜薹的第3節(jié)中以4-甲氧基-3-吲哚甲基芥子油苷含量最高外，其它菜薹各部位中均以1-甲氧基-3-吲哚甲基芥子油苷含量最高，在各個節(jié)間均以4-羥基-3-吲哚甲基芥子油苷含量最低;在澄海粗條中，1-甲氧基-3-吲哚甲基芥子油苷在菜薹第1節(jié)、第2節(jié)和第4節(jié)中含量最高，4-甲氧基-3-吲哚甲基芥子油苷在菜薹第3節(jié)中含量最高，在各個節(jié)間均以4-羥基-3-吲哚甲基芥子油苷含量最低;在全年油青中，菜薹各個節(jié)間中均以1-甲氧基-3-吲哚甲基芥子油苷含量最高，4-羥基-3-吲哚甲基芥子油苷含量最低.

不同種類吲哚芥子油苷組分在菜薹不同節(jié)間的變化趨勢不同(見表2).在中花和澄海粗條中，在菜薹最頂端4-羥基-3-吲哚甲基芥子油苷含量最高，顯著高于其它3節(jié)，在菜薹低端含量最低，而在全年油青中，4-羥基-3-吲哚甲基芥子油苷在檢測到的兩節(jié)中含量并無顯著差異.3-吲哚甲基芥子油苷在3個芥藍品種菜薹中均以第4節(jié)含量最高，顯著高于其它3節(jié)中的含量.4-甲氧基-3-吲哚甲基芥子油苷除在中花菜薹的第3節(jié)中含量顯著低于菜薹其它節(jié)外，澄海粗條和全年油青菜薹各節(jié)間含量差異均不顯著.1-甲氧基-3-吲哚甲基芥子油苷在3個芥藍品種中均以第4節(jié)含量最高.

圖4 芥藍菜薹不同節(jié)間總吲哚族芥子油苷含量Fig.4 Total indolyl GS content in different sections of bolting stems in Chinese kale

2.3.2 芥藍菜薹不同節(jié)間總吲哚族芥子油苷含量

表2 芥藍菜薹不同節(jié)間吲哚族芥子油苷組分及含量Table 2 Individual indolyl GS in different sections of bolting stems in Chinese kale

從圖4可以看出，3個芥藍品種中，中花菜薹的第4節(jié)總吲哚族芥子油苷含量(DW)最高，為1.34 μmol·g-1，全年油青菜薹第 1 節(jié)含量(DW)最低，僅為 0.15 μmol·g-1.在 3 個芥藍品種中，均以菜薹的第4節(jié)中總吲哚族芥子油苷含量最高，含量顯著高于菜薹其它節(jié)間，其它3個節(jié)間總吲哚族芥子油苷含量差異均不顯著.

3 討論

芥藍被認為是一種健康蔬菜，這主要源于其富含維生素C、礦物質(zhì)等，而對其豐富的芥子油苷種類和含量最近才得到重視.何洪巨等［5］在芥藍菜薹中檢測到7種芥子油苷，陳新娟等［7］、LA 等［13］分別在芥藍菜薹中檢測到10種和11種芥子油苷.在本試驗中除在菜薹部分節(jié)間只檢測到10種芥子油苷外，在菜薹其它節(jié)間均中檢測到11種芥子油苷，且只檢測到脂肪族和吲哚族兩大類芥子油苷，沒有檢測到芳香族芥子油苷，和前面的報道一致［3，7，10，13］.但本試驗中芥藍菜薹中芥子油苷的平均含量低于何洪巨、李建文等［5，6］所報道，和陳新娟等［7］、LA 等［13］報道一致，這可能與品種、檢測方法有關(guān).在檢測到的芥子油苷中，含量最高的均為3-丁烯基芥子油苷，而含量最低的芥子油苷在不同的芥藍品種和菜薹不同節(jié)間各不相同，這與何洪巨等［5］、李建文等［6］研究結(jié)論一致.尤其值得注意的是芥藍菜薹所含有的芥子油苷中，4-甲基亞硫酰丁基芥子油苷的降解產(chǎn)物蘿卜硫素(sulforaphane)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強的Ⅱ相酶抑制劑，能夠通過抑制癌癥細胞的分裂，誘導細胞程序化死亡等來延緩或逆轉(zhuǎn)癌癥的發(fā)生［14］;2-丙烯基芥子油苷和4-甲硫基丁基芥子油苷的分解物也具有防癌和抗癌的作用［15，16］.因此，芥藍是很有潛力的抗癌蔬菜.

研究表明［17］，芥子油苷種類變異一般科間＞屬間＞種間，而含量則變異較大，除受植株本身差異影響外，在同一植株中，也因部位的不同而不同.大多學者認為，除3-吲哚甲基芥子油苷，1-甲氧基-3-吲哚甲基芥子油苷外，一般芥子油苷在種子中含量最高，在一些植物種子中含量達到10%［18］，其次是莖，然后是葉，在根部含量最低［19］.在西蘭花中，菜薹和花蕾中的4-甲基亞硫酰丁基芥子油苷含量比其它的組織中都高［20］，而嫩芽中的4-甲基亞硫酰丁基芥子油苷的含量是成熟植株或花的 10 ～100 倍［21］.陳新娟等［7］對芥藍葉片和菜薹中芥子油苷的組分和含量進行了鑒定和分析，發(fā)現(xiàn)雖然人們習慣食用的菜薹中各芥子油苷組分的含量顯著高于葉片，但是葉片中也含有豐富的芥子油苷，尤其是葉片中吲哚族芥子油苷相對含量高于菜薹，因此建議消費者葉和薹一并食用，在提高芥藍利用率的同時也增加了人體對抗癌物質(zhì)的吸收.但是就一個組織器官進行詳細的研究還未見報道.本試驗對芥藍菜薹不同節(jié)間芥子油苷種類和含量進行分析，結(jié)果表明，在3個芥藍品種中，總芥子油苷、總脂肪族芥子油苷和總因吲哚族芥子油苷均在菜薹的最頂端含量最高.因此，在日常飲食中，為單獨提高膳食中芥子油苷的攝入量，可選取芥藍頂端的菜薹作為食用器官.有人推測，芥子油苷含量變化與該組織中芥子油苷的生物合成有關(guān)，然而研究發(fā)現(xiàn)在芥子油苷含量高的部位芥子油苷的生物合成活動卻不一定強烈.例如，在擬南芥各組織中，種子中芥子油苷含量最高，而在種子中與芥子油苷相關(guān)的生物合成活動卻很低，這表明芥子油苷在不同組織間可能存在著傳輸［22］.在用放射性同位素14C對旱金蓮(Tropaeolum majus)發(fā)育過程中芐基芥子油苷在各器官的生物合成的研究及對 B.napus cv.Cobra和 B.napus雜交 F1代的種子和葉子中脂肪族芥子油苷的組合模式與母體植株葉子中脂肪族芥子油苷的組合模式的研究中均表明，芥子油苷在植物不同部位間存在著傳輸，這種傳輸主要通過韌皮部的長距離傳輸來實現(xiàn)的［23～25］.一般情況下，在成熟葉片中合成的芥子油苷通過韌皮部的傳輸系統(tǒng)逐漸向花和果實轉(zhuǎn)移［26］，而自身組織中芥子油苷含量因芥子油苷的傳輸和分解而降低［27，28］.在本試驗中，在菜薹的最頂端芥子油苷含量最高，這符合芥子油苷的傳輸規(guī)律，即芥子油苷通過韌皮部向生殖器官中轉(zhuǎn)移，而在菜薹的前3節(jié)中芥子油苷含量差異不大，一方面這可能與其芥子油苷被傳輸?shù)巾敹擞嘘P(guān)，另一方面與其連接的葉子為衰老葉子，芥子油苷的生物合成活動較弱有關(guān).然而不同種類的芥子油苷在菜薹各個節(jié)間的變化趨勢不一致，這可能與不同種類芥子油苷的傳輸機制及生物合成過程不同有關(guān)，具體機理仍需進一步研究.

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