劉慧慧，李太武，蘇秀榕

（1.浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316004；2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波 315211）

紫貽貝Mytilus edulis Linnaeus俗稱青口、海紅，其干制品稱淡菜，有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、藥用和保健功效，是我國(guó)目前主要的貝類養(yǎng)殖品種之一，在山東、浙江、廣東等沿海省份都有廣闊的養(yǎng)殖海域。目前對(duì)紫貽貝的研究主要集中在組織學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)、養(yǎng)殖技術(shù)、分子特征[1]及雜交育種[2]等方面，對(duì)其受精機(jī)理的研究還未見報(bào)道。

在對(duì)受精機(jī)制的研究中，精子與卵細(xì)胞表面的糖蛋白受到了廣泛重視，應(yīng)用凝集素親和細(xì)胞化學(xué)方法，在多種動(dòng)物和人配子細(xì)胞表面已證實(shí)有糖蛋白分布，另有研究發(fā)現(xiàn)鮑精子頂體泡和卵細(xì)胞表面分布大量糖蛋白類物質(zhì)，是否貽貝的配子細(xì)胞也具有同樣特征，有待于研究證實(shí)。因此，我們選用可以特異性結(jié)合半乳糖、葡萄糖、甘露糖、巖藻糖（精卵識(shí)別中起重要調(diào)節(jié)作用）的熒光標(biāo)記凝集素，對(duì)紫貽貝配子細(xì)胞中對(duì)應(yīng)的糖進(jìn)行研究，以期為貽貝生殖機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品制備

貽貝新鮮的雌雄性腺組織用改良的Carnoy液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片（厚度為7 μm）。

1.2 凝集素

本實(shí)驗(yàn)所用FITC標(biāo)記的LCA（兵豆凝集素）、PNA（花生凝集素）、UEA（荊豆凝集素）、和WGA（麥胚凝集素）均購(gòu)自美國(guó)Sigma化學(xué)公司，LCA與α-D甘露糖特異性結(jié)合，PNA特異性結(jié)合α,β-半乳糖，WGA可與葡萄糖特異性識(shí)別，UEA則特異性識(shí)別巖藻糖，上述幾種凝集素的工作液濃度均為50 μg/mL。

1.3 凝集素細(xì)胞化學(xué)

切片按常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇重新增加水，再以蒸餾水沖洗，入0.1 mol/L pH 7.4 PBS（內(nèi)含1%牛血清白蛋白和 0.3%Triton X-100）洗 5 min×3，后轉(zhuǎn)入 PBSC（0.1 mol/L pH 7.2 的 PBS，含 0.1 mmol/L Ca-Cl2、MgCl2和MnCl2）20 min。除去多余液體后用微量注射器加上50 μg/mL FITC-凝集素（用PBSC稀釋），放在潮濕容器內(nèi)，37℃避光孵育0.5 h。PBS洗5 min×3，除去未被結(jié)合的標(biāo)記凝集素，熒光顯微鏡觀察（Olympus熒光顯微鏡，激發(fā)波長(zhǎng)490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm），照相。另有部分切片做HE染色以進(jìn)行結(jié)構(gòu)對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定

熒光顯微鏡下仔細(xì)觀察整個(gè)切片的染色情況，根據(jù)組織染色強(qiáng)度不同分為陰性（-）、弱陽性（+）、陽性(++)、強(qiáng)陽性 (+++)。

2 結(jié)果

2.1 紫貽貝卵細(xì)胞分布特征及凝集素標(biāo)記

貽貝卵巢是由薄層肌肉和結(jié)締組織將之分割成一個(gè)個(gè)小區(qū)或稱分枝的管狀結(jié)構(gòu)，管壁由復(fù)層上皮和非細(xì)胞結(jié)構(gòu)的基膜構(gòu)成，生殖上皮不斷向腔內(nèi)產(chǎn)生卵原細(xì)胞，再由之經(jīng)初、次級(jí)卵母細(xì)胞、最終發(fā)育為成熟的卵子。當(dāng)卵巢發(fā)育至成熟期時(shí)，管腔內(nèi)充滿成熟卵子，由于互相擠壓而表現(xiàn)為不規(guī)則的形狀，在隨之而來的排放期中，腔內(nèi)的成熟卵子明顯減少，多表現(xiàn)為圓形或橢圓形。實(shí)驗(yàn)中所觀察到的紫貽貝卵細(xì)胞正處于該期，其糖分布及含量如表1和圖版1所示。在濾泡間隔區(qū)和細(xì)胞核區(qū)，甘露糖、半乳糖、巖藻糖、葡萄糖都沒有分布，這4種糖在卵細(xì)胞邊緣的標(biāo)記特征亦不明顯，只是半乳糖和葡萄糖在一些卵細(xì)胞邊緣有區(qū)域性分布；但在細(xì)胞質(zhì)區(qū)，這4種糖均有少量分布。

表1 紫貽貝卵細(xì)胞熒光凝集素標(biāo)記強(qiáng)度Tab.1 Reaction of FITC-labeled lectin on eggs of Mytilus edulis

2.2 紫貽貝精子分布特征及凝集素標(biāo)記

紫貽貝的精巢是由無數(shù)的生殖小管纏繞在一起構(gòu)成的，各小管間由薄層肌肉和少量結(jié)締組織隔開。到了生殖高峰期，輸精小管內(nèi)充滿精子，僅在輸精小管邊緣有少量的精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精細(xì)胞按照由外向內(nèi)逐級(jí)呈輻射狀排列。精原細(xì)胞大，圓形或卵圓形，核大，形狀與細(xì)胞一致；初級(jí)精母細(xì)胞小于精原細(xì)胞，圓形，核圓形；次級(jí)精母細(xì)胞小于初級(jí)精母細(xì)胞，圓形，數(shù)量比初級(jí)精母細(xì)胞多，核圓形；精細(xì)胞小，圓形，核大多呈半月形；精子最小，三角形，集中于生精小管腔中央，懸浮于精液中。

半乳糖和巖藻糖在紫貽貝的精巢的精細(xì)胞和成熟精子區(qū)為較均勻的弱陽性標(biāo)記，根據(jù)甘露糖和葡萄糖在貽貝精巢中的分布狀況，可將其分為4個(gè)區(qū)域（圖版Ⅱ）：輸精小管間隔區(qū)、輸精小管邊緣、精母細(xì)胞區(qū)、精子區(qū)，甘露糖僅在輸精小管邊緣有分布；葡萄糖的含量相對(duì)較多，但也只是在輸精小管邊緣以及成熟精子區(qū)有一定的標(biāo)記。

表2 貽貝精子細(xì)胞熒光凝集素標(biāo)記強(qiáng)度Tab.2 Reaction of FITC-labeled lectin on sperms of M.edulis

3 討論

3.1 糖在紫貽貝卵細(xì)胞的分布

前人[3]通過觀察卵的超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，大多未受精的動(dòng)物卵細(xì)胞由糖蛋白外被或卵黃膜包圍著，貝類也不例外，鮑的卵細(xì)胞由一層隆起的、約6 μm厚的卵黃膜包被，該層卵黃膜由很多糖蛋白纖絲緊密纏繞構(gòu)成[4]。本研究證實(shí)，甘露糖、巖藻糖在貽貝卵膜區(qū)無明顯標(biāo)記，半乳糖和葡萄糖在一些卵細(xì)胞邊緣有區(qū)域性分布，說明不同糖在卵細(xì)胞膜上的分布和含量存在變化，而這些變化直接影響著卵細(xì)胞膜上糖蛋白中糖的組成和結(jié)構(gòu)，可能造成不同品種貽貝卵細(xì)胞上配子識(shí)別物的差異，進(jìn)而決定其配子之間的特異性識(shí)別。

紫貽貝卵細(xì)胞質(zhì)中4種凝集素均表現(xiàn)為弱陽性標(biāo)記，說明卵細(xì)胞中含有甘露糖、半乳糖、巖藻糖、葡萄糖等糖基，還可能存在若干我們未檢測(cè)到的其他種類的糖。這些糖在細(xì)胞質(zhì)中以何種方式存在還未知。人們通過研究鋸緣青蟹Scylla serrata[5]、中華絨螯蟹Eriocheir sinensis[6]、羅氏沼蝦Macrobrachium rosenbergii[7]、中國(guó)鱟 Tachpleus tridentatus[8]、縊蟶 Sinonovacula constricta[9]、櫛孔扇貝 Chlamys(Azumapecten)farreri[10]、太平洋牡蠣Olympia oysters[11]、文蛤Meretrix meretrix、微黃鐮玉螺Lunatia gilva[12]等無脊椎動(dòng)物的卵細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及卵黃形成過程發(fā)現(xiàn)，卵黃的形成與細(xì)胞核、線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核糖體等細(xì)胞器密切相關(guān)，其中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是卵黃粒形成的主要場(chǎng)所，并且粗面和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)又與糖類的合成有關(guān)，因此來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的卵黃顆粒中往往含有一定的糖類物質(zhì)；高爾基體具有合成糖蛋白的功能，所以經(jīng)過高爾基體釀造、加工而形成的卵黃粒中含有糖蛋白。本實(shí)驗(yàn)中貽貝的卵細(xì)胞質(zhì)中，4種糖均有弱陽性標(biāo)記，可能就是那些來自于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的卵黃顆粒通過其中糖蛋白與熒光標(biāo)記凝集素結(jié)合而表現(xiàn)出來的。另外，羅氏沼蝦的卵細(xì)胞在卵黃形成后期，仍能見到高爾基體通過它的細(xì)小管道向已形成的卵黃粒輸送它的合成產(chǎn)物[6]，櫛孔扇貝卵細(xì)胞成熟過程中，細(xì)胞質(zhì)中的糖成分不斷增多[13]。本研究中的4種糖在紫貽貝細(xì)胞質(zhì)中廣泛存在，這些糖類可能存在于卵細(xì)胞質(zhì)中的卵黃顆粒中，其存在形式不只是糖蛋白，也可能還包括多糖類物質(zhì)。

3.2 精子中糖的分布

精子中的配子識(shí)別物位于頂體中，VACQUIER等[14]曾對(duì)鮑精子識(shí)別蛋白進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，決定生殖隔離的識(shí)別蛋白（lysin和sp18）就位于成體鮑的發(fā)達(dá)頂體泡中。本研究中半乳糖和巖藻糖在紫貽貝精巢的精細(xì)胞和成熟精子區(qū)為較均勻的弱陽性標(biāo)記，甘露糖僅在輸精小管邊緣有分布；葡萄糖的含量相對(duì)較多，但也只是在輸精小管邊緣以及成熟精子區(qū)有一定的標(biāo)記，該結(jié)果說明，貽貝精子形成過程中，不同糖類物質(zhì)的產(chǎn)生的先后順序有所差別，起到識(shí)別作用的糖蛋白的組成和分布也可能不同。該結(jié)論與前人研究哺乳動(dòng)物[15]及昆蟲[16]精子得到的糖蛋白分布具有變化性特征的結(jié)論相似。

成熟精子中糖主要存在于精子的頂體部分，頂體是由前頂體顆粒逐漸發(fā)育形成的，前頂體顆粒出現(xiàn)的時(shí)期在不同貝類中有差異，合浦珠母貝Pinctada fucata在初級(jí)精母細(xì)胞期形成，而企鵝珍珠貝Pteria penguin則在次級(jí)精母細(xì)胞和精子細(xì)胞時(shí)期形成[17]，櫛孔扇貝前頂體顆粒在次級(jí)精母細(xì)胞初期開始形成，在精子細(xì)胞變態(tài)的早期是一個(gè)繼續(xù)和增強(qiáng)的過程[18]。紫貽貝的精子發(fā)生過程中，葡萄糖基的分布變化特征最為明顯，但這種糖類物質(zhì)是在精細(xì)胞發(fā)育階段的哪一期產(chǎn)生，是在前頂體顆粒形成時(shí)已經(jīng)存在，在頂體發(fā)育過程中包裝到頂體泡中，還是隨著頂體的形成而逐步合成的，需要用電鏡的方法進(jìn)一步確定。另外，許多研究者借助能與糖專一性結(jié)合的凝集素對(duì)各種哺乳動(dòng)物精子表面糖復(fù)合物進(jìn)行研究表明，精子表面的糖復(fù)合物出現(xiàn)與睪丸內(nèi)的發(fā)生階段，在附睪內(nèi)的成熟過程中發(fā)生明顯的修飾，而體外或體內(nèi)獲能時(shí)仍有某種程度的改變。貽貝和哺乳動(dòng)物的這種變化特征除了與種的特異性有關(guān)以外，還可能與其生理功能的發(fā)揮密切相關(guān)。

細(xì)胞表面糖蛋白中糖的特性對(duì)于細(xì)胞的相互識(shí)別起著重要作用，無論是實(shí)驗(yàn)條件下使配子細(xì)胞表面的糖殘基缺失，還是由于自身免疫病使精子表面糖基被掩蓋均可導(dǎo)致精卵不能結(jié)合，這表明配子細(xì)胞表面糖蛋白的糖組分是精卵結(jié)合所必需的。精卵識(shí)別是精子頭部表面糖蛋白的糖殘基與卵細(xì)胞表面糖蛋白的糖殘基互補(bǔ)配對(duì)的過程，即互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)匹配的過程，這是保證配子種間特異性結(jié)合的分子基礎(chǔ)。本研究證實(shí)在紫貽貝精巢和卵巢分布區(qū)不同程度含有甘露糖、半乳糖、葡萄糖、巖藻糖，糖種類和數(shù)量的差異體現(xiàn)了配子細(xì)胞表面糖基的組成的差別，決定了同種生物配子間識(shí)別的特異性。鄧澤沛等[15]研究指出，麥胚凝集素（WGA）結(jié)合糖復(fù)合物是精卵結(jié)合所必需的，是否其他幾種凝集素所結(jié)合的糖復(fù)合物也在精卵識(shí)別及結(jié)合中也發(fā)揮必不可少的作用，以及在低等貝類中，這些凝集素受體是否也具有該特征，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

[1]HEIKO S,KATRIN M,SASCHA P,et al.Detection and Characterization of Gamete-Specific Molecules in Mytilus edulis Using Selective Antibody Production[J].Molecular Reproduction&Development,2009,76:4-10.

[2]CAREN E B,GEORGE N S.Ecological gradients and relative abundance of native(Mytilus trossulus)and invasive(Mytilus galloprovincialis)blue mussels in the Californiahybrid zone[J].Marine Biology,2006,148:1 249-1 262.

[3]MOZINGO N M,VACQUIER V D,CHANDLER D E.Structural features of the abalone egg extracellar matrix and its role in gamete interaction during fertilization[J].Mol Rep And Devel,1995,41:493-502.

[4]SWANSON W J,VACQUIER V D.The abalone egg vitelline envolope receptor for sperm lysin is a giant multivalent molecule[J].Proc Natl Acad Sci,1997,94:6 724-6 729.

[5]成永旭,李少菁,王桂忠,等.鋸緣青蟹卵黃發(fā)生期卵母細(xì)胞和卵泡細(xì)胞之間的結(jié)構(gòu)變化[J].動(dòng)物學(xué)報(bào),2002,48(1):80-92.

[6]堵南山,賴 偉,陳鵬程,等.中華絨螯蟹卵黃形成的研究[J].動(dòng)物學(xué)報(bào),1999,45(1):88-92.

[7]姜乃澄,盧建平,袁保京.羅氏沼蝦初級(jí)卵母細(xì)胞在卵黃形成期超微結(jié)構(gòu)的變化[J].東海海洋,2001,19(1):35-43.

[8]夏傳武,洪水根,虢華珊.中國(guó)鱟卵黃發(fā)生的電子顯微鏡研究[J].華中師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,1998,32(2):215-218.

[9]上官步敏,劉正琮.縊蟶卵母細(xì)胞卵黃發(fā)生過程的超微結(jié)構(gòu)研究[J].海洋與湖沼,1995,26(1):48-52.

[10]劉德模,洪水根.櫛孔扇貝卵母細(xì)胞卵黃發(fā)生的研究[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,1996,35(3):412-416.

[11]任素蓮,王德秀,王如才.太平洋牡蠣卵母細(xì)胞發(fā)育及卵黃發(fā)生的超微結(jié)構(gòu)[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),1999,6(4):2-5.

[12]應(yīng)雪萍,楊萬喜.微黃鐮玉螺卵黃發(fā)生過程中細(xì)胞器的變化[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào):理學(xué)版,2003,30(7):204-209.

[13]劉衛(wèi)東.櫛孔扇貝卵發(fā)生的超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞化學(xué)[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),1999,5(6):593-597.

[14]VACQUIER V D.Evolution of gamete recognition protein[J].Science,1998,281:1 995-1 998.

[15]鄧澤沛,周占祥,孫秀華,等.小鼠精子表面SBA結(jié)合糖復(fù)合物的形成與變化[J].中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,1997,6(1):67-72.

[16]奚耕思,楊月紅,鄭哲民.蟋蟀精子表面LCA及ConA結(jié)合糖復(fù)合物的分布變化[J].動(dòng)物學(xué)報(bào),2002,48(1):125-130.

[17]杜曉東.3種珍珠貝精子發(fā)生及其超微結(jié)構(gòu)的比較研究[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,1996,42(2):219-224.

[18]任素蓮,王德秀,繩秀珍.櫛孔扇貝精子形成中的核變化與頂體形成[J].青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào),1999,29(4):591-594.

圖版Ⅰ 紫貽貝卵巢組織結(jié)構(gòu)及糖分布PlateⅠ Histological structure and carbohydrate distribution of ovary in Mytilus edulis

圖版Ⅱ 紫貽貝精巢組織結(jié)構(gòu)及糖分布PlateⅡ Histological structure and carbohydrate distribution of spermary in M.edulis