徐 魁，周 云

(咸寧學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院診斷學(xué)教研室，湖北 咸寧 437100)

橋本甲狀腺炎(HT)屬于自身免疫性甲狀腺病(AITD)，是最常見(jiàn)的甲狀腺疾病。近年來(lái)的研究表明，其發(fā)病率有逐漸上升的趨勢(shì)，一定程度上影響著人類(lèi)健康。因此研究誘致本病發(fā)病的相關(guān)因素，對(duì)于探討該病的發(fā)病機(jī)制和臨床監(jiān)測(cè)與防治具有重要意義。最近發(fā)現(xiàn)HT患者的甲狀腺上皮細(xì)胞成為抗原遞呈細(xì)胞(APC)表達(dá)抗原，提呈抗原，刺激輔助性T細(xì)胞，從而啟動(dòng)自身免疫反應(yīng)。但是哪些抗原在HT中表達(dá)，目前尚不清楚。HLA-DR是T細(xì)胞激活的第一信號(hào);CD40是T細(xì)胞共刺激分子之一。與MHC-I和MHC-II類(lèi)分子提呈多肽抗原不同，CD1分子提呈脂質(zhì)抗原給T細(xì)胞。本研究旨在觀(guān)察CD40、CD1a、HLA-DR是否在橋本甲狀腺炎中表達(dá)及其與橋本甲狀腺炎的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院病理科甲狀腺手術(shù)后組織蠟塊，橋本甲狀腺炎36例(男15例，女21例)，患者年齡20～45歲，其中8例合并甲狀腺腺瘤，余無(wú)任何合并癥及并發(fā)癥，未服用任何藥物，既往身體健康，無(wú)特殊疾病史;甲狀腺瘤旁正常組織10例(男4例，女6例)，年齡20～45歲，為正常對(duì)照組，均經(jīng)病理切片證實(shí)診斷。標(biāo)本經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)方法

石蠟切片常規(guī)脫蠟，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，抗原修復(fù)，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(S-A/HRP)染色，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、中性樹(shù)脂封片。(具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)。所有一抗為鼠抗人CD40(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、CD1a和HLA－DR(武漢凌飛科技有限公司)，HRP/DAB二抗通用試劑盒，PBS緩沖液代替一抗做陰性對(duì)照組。

1.2.2 定性分析

根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比為4級(jí)。觀(guān)察全片，無(wú)免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞或陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%者(－);染色陽(yáng)性細(xì)胞較少(＜25%)，陽(yáng)性較弱且散在分布者為(+);免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞較多且分布密集有25% ～50%者為(++);免疫染色很多且分布很密集＞50%的細(xì)胞陽(yáng)性者為(+++)。

1.2.3 定量分析

采用HMIAS-2000型全自動(dòng)醫(yī)學(xué)彩色圖像分析系統(tǒng)中的免疫組化測(cè)量系統(tǒng)，在相同的放大倍數(shù)、高度、對(duì)比度和飽和度下測(cè)量吸光度。每張玻片選擇具有代表性的十個(gè)不重復(fù)的視野進(jìn)行測(cè)量，并計(jì)算其平均值和半定量分析。吸光度代表標(biāo)本中所測(cè)量蛋白的相對(duì)含量，組織染色越強(qiáng)，吸光度越大，所測(cè)蛋白含量越高。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 CD40、CD1a、HLA-DR 在橋本甲狀腺炎患者甲狀腺組織中的表達(dá)

CD40、CD1a、HlA-DR在 HT的甲狀腺組織標(biāo)本中均呈陽(yáng)性染色(見(jiàn)圖1、圖2和圖3)，陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色顆粒，陽(yáng)性染色區(qū)域主要位于甲狀腺濾泡細(xì)胞的胞質(zhì)及胞膜上。正常甲狀腺組織幾乎不表達(dá) CD40、CD1a、HlA-DR，呈陰性表達(dá)，見(jiàn)圖4。

圖1 CD40在HT甲狀腺濾泡上皮呈強(qiáng)陽(yáng)性著色(HRP×200)

圖2 CD1a在HT甲狀腺濾泡上皮呈強(qiáng)陽(yáng)性著色(HRP×200)

圖3 HLA-DR在HT甲狀腺濾泡上皮呈強(qiáng)陽(yáng)性著色(HRP×200)

圖4 CD40在正常組甲狀腺濾泡上皮任何部位都不著色(HRP×200)

2.2 HT和正常對(duì)照甲狀腺上皮CD1a、HLA-DR、CD40表達(dá)水平的定量分析

用t檢驗(yàn)分析，結(jié)果顯示HT患者CD1a、HLADR和CD40陽(yáng)性率明顯高于正常對(duì)照組，有顯著性差異(P＜0.01)，見(jiàn)表1。

表1 CD1a、HLA-DR、CD40在HT和NTG甲狀腺組織中的表達(dá)()

表1 CD1a、HLA-DR、CD40在HT和NTG甲狀腺組織中的表達(dá)()

NC組與組HT比較，*P＜0.01

組別 例數(shù) 抗原 平均光度 免疫組化表達(dá)強(qiáng)度-+++ +++NC 10 CD1a 0.0023 ±0.0002 9 1 0 010 HLA-DR 0.0023 ±0.0006 9 1 0 010 CD40 0.0024 ±0.0006 8 2 0 0 HT 36 CD1a 0.2651 ±0.0373* 1 9* 16* 10*28 HLA-DR 0.2584 ±0.0412* 0 4* 14* 10*28 CD40 0.2684 ±0.0422* 0 5* 13* 10*

2.3 HT和正常對(duì)照甲組狀腺上皮 CD1a、HLADR、CD40表達(dá)強(qiáng)度半定量分析

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CD1a在正常甲狀腺組織只有非常少的表達(dá)，為弱陽(yáng)性，HT患者絕大多數(shù)有CD1a表達(dá)，且表達(dá)較強(qiáng)，以中度和重度表達(dá)為主，中度表達(dá)為44.4%，重度表達(dá)為27.8%;HLA-DR幾乎不表達(dá)正常甲狀腺組織，但高表達(dá)于HT，以中重度為主，中度陽(yáng)性表達(dá)占50.0%，重度表達(dá)占35.7%;CD40在HT表達(dá)，以中重度為主，中度陽(yáng)性表達(dá)13例，占46.0%，重度35.7%，正常甲狀腺組織10例中僅有兩例表達(dá)弱陽(yáng)性。卡方檢驗(yàn)顯示HT和正常組有顯著性差異，P＜0.01，見(jiàn)表1。

3 討論

橋本甲狀腺炎是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病。T細(xì)胞激活必須依賴(lài)雙重信號(hào)，HLA-DR是T細(xì)胞激活的第一信號(hào)，主要在抗原遞呈細(xì)胞上表達(dá)，HLA-DR的表達(dá)程度反映了細(xì)胞遞呈抗原的能力。第二信號(hào)來(lái)自APC表面表達(dá)的共刺激分子如 CD40-CD40L、B7.1-CD28及 ICAM-LFA-1等，沒(méi)有協(xié)同刺激信號(hào)的參與則導(dǎo)致T細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性或細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生外周耐受，若第二信號(hào)刺激過(guò)度，則可激活自身反應(yīng)性T細(xì)胞，導(dǎo)致自身免疫的發(fā)生。

Tanclon N等研究證明正常人甲狀腺濾泡不表達(dá)HLA-DR抗原，在橋本甲狀炎患者中可見(jiàn)到HLA-DR高表達(dá)。蘇敏等報(bào)道自身免疫甲狀腺疾病異常表達(dá)DR抗原，以HT最強(qiáng)，其次GD伴甲狀腺炎，隨著DR抗原異常表達(dá)增加，部分GD患者逐漸發(fā)展為伴甲狀腺炎，最終為HT，說(shuō)明甲狀腺上皮的DR抗原異常表達(dá)程度能評(píng)估甲狀腺免疫病理狀態(tài)。Bottazo GF等研究證實(shí)AITD患者的甲狀腺細(xì)胞異常表達(dá)MHC-II類(lèi)抗原、粘附分子ICAM-1、VCAM-1?，F(xiàn)在多種研究表明橋本甲狀腺炎患者表達(dá)人白細(xì)胞抗原(HLA-DR)的T淋巴細(xì)胞增多。

有研究發(fā)現(xiàn)CD40分子與AITD有關(guān)，Jacobson EM，Tomer Y發(fā)現(xiàn)CD40分子有關(guān)基因與自身免疫性甲狀腺疾病密切相關(guān)［1］。Kie JH等人，通過(guò)研究10例Graves患者，14例HT患者，11例非特異性甲狀腺炎者，11例亞急性肉芽腫甲狀腺炎，3例正常患者，發(fā)現(xiàn)CD40不表達(dá)于正常甲狀腺濾泡上皮，但表達(dá)于其它甲狀腺炎，且發(fā)現(xiàn)甲狀腺濾泡上皮CD40和Fas-l表達(dá)有密切相關(guān)［2］。Metcalfe等人用流式細(xì)胞儀和TFC擴(kuò)散計(jì)數(shù)方法均證實(shí)在GD和HT的TFC上有CD40的表達(dá)，該實(shí)驗(yàn)還顯示IFN-γ和IL-la可增加CD40的表達(dá)［3］。

另一方面，Smith等人研究結(jié)果顯示CD40分子在AITD和非AITD中均廣泛表達(dá)［4］。本研究結(jié)果顯示CD40分子在HT中高表達(dá)，在正常組不表達(dá)，提示CD40與HT相關(guān)。

CD1在1979年被發(fā)現(xiàn)，是單克隆抗體識(shí)別的白細(xì)胞抗原。CD1分子有4種異構(gòu)體即CD1a、CD1b、CD1c 和 CD1d。CD1a、CD1b、CD1c 具有同源性較高，而CD1d與前三種分子的同源性較差。Brenner試驗(yàn)室首先將CD1b分子與CD1b特異的脂質(zhì)抗原結(jié)合，發(fā)現(xiàn)他們能特異性激活αβ+T細(xì)胞，誘導(dǎo)出針對(duì)該脂質(zhì)抗原的特異性免疫應(yīng)答。現(xiàn)已證實(shí)CD1分子與多種自身免疫性疾病相關(guān)，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、多發(fā)性硬化征、Ⅰ型糖尿病等。Roura-Mir C等人研究AITD，發(fā)現(xiàn)甲狀腺組織中淋巴濾泡外圍CD83+樹(shù)突狀細(xì)胞高表達(dá) CD1a、CD1b、CD1c，CD20+IgD+CD23-CD38-B細(xì)胞高表達(dá)CD1c，在自身免疫甲狀腺炎早期，甲狀腺組織高表達(dá)CD1［3］。CD1高表達(dá)于橋本甲狀腺炎的甲狀腺濾泡上皮。

綜上所述，HLA-DR、CD40不表達(dá)于正常甲狀腺濾泡上皮，表達(dá)于HT甲狀腺濾泡上皮，這些表明HT中的甲狀腺上皮細(xì)胞成為抗原呈遞細(xì)胞提供T細(xì)胞活化所需的兩種信號(hào)。因此甲狀腺上皮在T細(xì)胞激活發(fā)揮重要作用。臨床結(jié)果顯示已證實(shí)大劑量甲狀腺素片可明顯抑制甲狀腺上皮的DR抗原的表達(dá)。CD1a高表達(dá)于HT的甲狀腺濾泡上皮，可能CD1提呈脂質(zhì)抗原給T細(xì)胞在HT的發(fā)病中起一定的作用。

［1］Jacobson EM，Tomer Y.The genetic basis of thyroid autoimmunity Thyroid.J Autoimmun，2007，28(2-3):85

［2］Kie JH，Cho MS，Yang WI Expression of CD40 and apoptosis related molecules in autoimmune thyroid diseases Yonsei Med J，2001，42(5):488

［3］Metcalfe RA，Mcintosh SR，Marelli-berg F，etal.Detection of CD40 on human thyroid follicular cells:analysisof expression and function［J］.J Clin Endocrinol Metab，1998，83(4):1268

［4］Smith TJ，Sciaky D，Phipps RP，et al.CD40 expression inhuman thyroid tissue:evidence for involvement of multiple cell types in autoimmune and neoplastic disease［J］.Thyroid.1999，9(8):749

［5］Roura-Mir C，Catálfamo M，Cheng TY，et al.CD1a and CD1c activate intrathyroidal T cells during Graves＇disease and Hashimoto＇s thyroiditis［J］.Immunol，2005，174(6):3773