韓 璐

(咸寧學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，湖北 咸寧 437100)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是臨床常見(jiàn)急腹癥之一［1］，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，一直以來(lái)是臨床值得進(jìn)一步探討的問(wèn)題。

血漿內(nèi)皮素(Endothelin，ET)和一氧化氮(Nitric oxide，NO)被認(rèn)為參與了胰腺微循環(huán)障礙的主要因子［2］。AP發(fā)生后，胰腺及其他臟器微血管內(nèi)皮細(xì)胞遭受損傷，繼而釋放細(xì)胞因子和血管活性介質(zhì)，ET和NO分別是重要縮血管介質(zhì)和舒血管介質(zhì)。ET使胰腺微血管痙攣，胰腺缺血，減少胰腺血流，使紅細(xì)胞血流速率及機(jī)能毛細(xì)血管密度下降，ET還與胰腺ET受體結(jié)合，使腺泡細(xì)胞內(nèi)鈣超載，損傷胰腺細(xì)胞，引起腺泡壞死［3］。而NO具有強(qiáng)烈松弛血管平滑肌細(xì)胞、調(diào)節(jié)微血管的通透性和胰腺血流、抑制白細(xì)胞粘附和血小板凝集以及調(diào)節(jié)胰腺腺體分泌等作用，對(duì)AP微循環(huán)有保護(hù)作用［4］。

葛根素(puerarin)是由豆科植物野葛、甘葛藤根中提取的一種黃酮苷，化學(xué)名8-β-D-葡萄吡喃糖-4＇，7-二羥基異黃酮，臨床上主要用于冠心病、高血壓、高粘血癥、腦梗死、糖尿病、缺血性視神經(jīng)病變等多種疾病治療。有報(bào)道［5］葛根素對(duì)大鼠腦和臟器組織NO體系的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葛根素增加組織NOS活性和NO含量。葛根素注射液可通過(guò)改善血循環(huán)狀態(tài)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能有保護(hù)作用，調(diào)節(jié)ET、NO代謝失衡狀況，從而調(diào)節(jié)血管舒縮功能［6］。

本實(shí)驗(yàn)的目的是通過(guò)觀察急性胰腺炎大鼠血漿中ET和NO的變化，探討葛根素對(duì)急性胰腺炎胰腺微循環(huán)的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

取武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)雄性SD大鼠54只，體質(zhì)量200～250g，隨機(jī)分為急性胰腺炎組(模型對(duì)照組，AP組)、假手術(shù)組(SO組)、葛根素治療組(P組)，每組18只。

1.2 試劑及儀器

主要試劑:5%?；悄懰徕c，葛根素注射液(50mg/2ml北京協(xié)和藥廠)，6%水合氯醛，NO等試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，ET試劑盒購(gòu)自北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司。BS60三用恒溫水箱，SZ-97自動(dòng)三重純水蒸餾器，超低溫冰箱，2T定時(shí)漩渦混勻器等。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟及方法

AP組:大鼠術(shù)前禁食12h，不禁水，用6%水合氯醛(0.35ml/100g)腹腔注射麻醉。在無(wú)菌操作下行腹正中切口切開(kāi)大鼠腹部，顯露十二指腸及主胰管。用無(wú)損傷小動(dòng)脈夾先夾閉近肝門處肝總管，以4.5號(hào)頭皮針經(jīng)十二指腸乳頭逆行穿刺主胰管末端，無(wú)損傷血管夾夾閉主胰管末端，緩慢勻速注射5%?；悄懰徕c(0.1ml/100g)，注射時(shí)間為2～3min，完畢后拔除頭皮針，無(wú)損傷血管夾保留5min。5min后肉眼下可見(jiàn)胰腺組織充血水腫后去掉肝門部和針頭插入部位的無(wú)損傷血管夾，逐層關(guān)腹。造模完畢后皮下注射生理鹽水(2ml/100g)補(bǔ)液。大鼠禁食，自由飲水。造模后30min向腹腔注射生理鹽水(0.8ml/100g)。

SO組:6%水合氯醛腹腔注射(0.35ml/100g)麻醉后開(kāi)腹，僅翻動(dòng)十二指腸。同AP組造模后30min向腹腔注射生理鹽水(0.8ml/100g)。

P組:造模方法同AP組，造模后30min向腹腔注射葛根素(20mg/100g)。

各組動(dòng)物于術(shù)后6h、12h、24h 3個(gè)時(shí)段大鼠分批(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只)處死，股動(dòng)脈采血分離血清于－20℃保存。檢測(cè)ET和NO的變化;取胰頭部胰腺組織用于光鏡組織病理學(xué)檢查。

1.4 統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié)果

2.1 胰腺組織大體情況

SO組大鼠胰腺肉眼觀呈淡粉紅色，薄片狀，顏色均勻一致，光澤度好，腸系膜及腎周無(wú)皂化斑。AP組造模后肉眼可見(jiàn)胰腺明顯水腫，呈囊腫樣變，伴有出血壞死，后腹膜、腎前筋膜和腸系膜可見(jiàn)皂化區(qū)，腹腔有腹水，且隨造模時(shí)間延長(zhǎng)病變逐漸加重;P組大鼠胰腺肉眼觀與AP組相似，但病變程度較AP組輕，胰腺水腫、出血壞死范圍縮小，后腹膜、腎前筋膜和腸系膜皂化區(qū)范圍縮小。

2.2 胰腺組織光鏡觀察及病理評(píng)分

SO組光鏡下胰腺組織基本正常，AP組可見(jiàn)胰腺腺泡水腫及腺泡結(jié)構(gòu)消失，葉間隔、小葉間隔廣泛性擴(kuò)張，部分胰腺組織腺泡間隔甚至細(xì)胞間隔顯著增寬;大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，小葉內(nèi)和血管周圍炎癥細(xì)胞明顯增多;腺泡細(xì)胞呈不同程度變性壞死，血管外和間隔內(nèi)出血明顯。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，病變呈進(jìn)行性加重。P組可見(jiàn)葉間隔、小葉間隔廣泛性擴(kuò)張較AP組減輕;胰腺水腫、血管外和間隔內(nèi)出血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均較AP組減輕，少數(shù)偶見(jiàn)局灶性腺泡細(xì)胞變性壞死。附圖1～3。

圖1 SO組胰腺組織切片(HE×200)

圖2 AP組胰腺組織切片(HE×200)

圖3 P組胰腺組織切片(HE×200)

病理評(píng)分:P組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)胰腺病理?yè)p傷程度逐漸增強(qiáng)，從6h到12h的變化不明顯(P＞0.05)，但從12h到24h比較顯著(P＜0.01)，其病損程度均高于同時(shí)間點(diǎn)SO組(P＜0.01)，但與同時(shí)間點(diǎn)AP組比較，均有所減輕，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(6h P＜0.05，12h、24h P＜0.01)，見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠胰腺組織病理評(píng)分結(jié)果()

表1 3組大鼠胰腺組織病理評(píng)分結(jié)果()

與同時(shí)間點(diǎn)SO組比較，*P＜0.01;與同時(shí)間點(diǎn)AP組比較，△P＜0.01;與同時(shí)間點(diǎn) AP組比較，#P＜0.05

組 別 胰腺組織病理評(píng)分6h 12h 24h AP 組 6.41 ±1.24* 8.83 ±0.98* 10.91 ±1.24*SO 組 0.50 ±0.63 0.75 ±0.61 0.67 ±0.61 P 組 5.25 ±0.76*#6.25 ±0.61＊△ 8.17 ±0.68＊△

2.3 血清ET、NO水平檢測(cè)結(jié)果

P組血清ET水平明顯升高，三個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間變化顯著(P＜0.01)，與同時(shí)間點(diǎn)SO組相比P組ET水平顯著升高(P＜0.01);P組與同時(shí)間點(diǎn)AP組相比，ET水平較低，其中12h、24h時(shí)段最明顯，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)表2。

表2 3組大鼠血清ET檢測(cè)結(jié)果(pg/ml，)

表2 3組大鼠血清ET檢測(cè)結(jié)果(pg/ml，)

與同時(shí)間點(diǎn)SO組比較，*P＜0.01;與同時(shí)間點(diǎn)AP組比較，△P＜0.01

組 別 ET 6h 12h 24h AP 組 72.18 ±4.62* 116.55 ±12.22* 125.45 ±13.28*SO 組 30.30 ±3.30 32.71 ±3.91 35.09 ±2.11 P 組 65.90 ±5.81* 88.54 ±6.69＊△ 106.27 ±9.86＊△

P組NO水平逐漸升高，尤其是從12h到24h比較顯著(P＜0.01)，與同時(shí)間點(diǎn)SO組相比，NO水平顯著升高(P＜0.01);與同時(shí)間點(diǎn)AP組相比，P組NO水平明顯較高，各時(shí)間點(diǎn)的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，其中12h和24h P＜0.01)，見(jiàn)表 3。

表3 3組大鼠血清NO檢測(cè)結(jié)果()

表3 3組大鼠血清NO檢測(cè)結(jié)果()

與同時(shí)間點(diǎn)SO組比較，*P＜0.01;與同時(shí)間點(diǎn)AP組比較，△P＜0.01;與同時(shí)間點(diǎn) AP組比較，#P＜0.05

6h 12h 24h AP 組 72.65 ±3.20* 87.33 ±6.37* 114.03 ±14.13組別 NO*SO 組 38.52 ±3.12 41.00 ±3.93 45.07 ±3.52 P 組 82.75 ±13.26*#105.34 ±8.08＊△ 129.95 ±7.53＊△

P組血清ET/NO比值在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異不大，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，與同時(shí)間點(diǎn)SO組相比也無(wú)顯著差異(P＞0.05);P組與同時(shí)間點(diǎn)AP組相比，ET/NO比值明顯較低，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)表4。

表4 3組大鼠血清ET/NO()

表4 3組大鼠血清ET/NO()

與同時(shí)間點(diǎn)SO組比較，*P＜0.01;與同時(shí)間點(diǎn)AP組比較，△P＜0.01

6h 12h 24h AP 組 0.99 ±0.03* 1.33 ±0.06* 1.12 ±0.24組別 ET/NO*SO 組 0.79 ±0.09 0.80 ±0.09 0.77 ±0.02 P 組 0.81 ±0.15△ 0.84 ±0.03△ 0.81 ±0.06△

3 討論

3.1 ET、NO和急性胰腺炎的關(guān)系

急性腺腺炎早期，往往都有微循環(huán)的障礙，毛細(xì)血管先缺血繼而血流淤積，毛細(xì)血管通透性增加和微血栓形成。胰腺小葉內(nèi)微動(dòng)脈易因高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化和惡性高血壓等疾病引起痙攣、栓塞、血栓形成或間質(zhì)水腫而出現(xiàn)所支配區(qū)組織供血不足，這可能是AP發(fā)病的始動(dòng)因子。而胰腺持續(xù)缺血可能是AP持續(xù)惡化的重要因素，大量的血管活性物質(zhì)如內(nèi)皮素、一氧化氮、緩激肽、血小板活化因子等均在胰腺微循環(huán)障礙中起重要作用。

ET是一種極強(qiáng)的縮血管介質(zhì)。Plusczyk等［7］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn) ET-1、ET-2和ET-3均可導(dǎo)致微循環(huán)損害、組織損傷和炎癥。Inoue等［8］通過(guò)臨床觀察發(fā)現(xiàn)，SAP患者血漿ET-1濃度異常升高，并通過(guò)大鼠AP模型檢測(cè)到胰腺中有ET-1 mRNA表達(dá)，因此認(rèn)為ET-1會(huì)加劇內(nèi)臟微循環(huán)障礙并可使胰腺和腸道因持續(xù)缺血而最終導(dǎo)致壞死。NO是一種舒血管介質(zhì)，目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，低水平的NO通過(guò)舒張血管平滑肌降低外周阻力，維持正常血壓，減少血小板聚集和改善微循環(huán)的途徑對(duì)胰腺起保護(hù)作用。Mettu等［9］通過(guò)臨床觀察證實(shí)SAP患者早期血清NO水平升高。

急性胰腺炎病程中，盡管ET和NO水平均明顯升高，但ET與NO的比值升高，使得ET的縮血管作用占優(yōu)勢(shì)，加重了胰腺微血管的痙攣及內(nèi)皮細(xì)胞的缺血性損傷，微循環(huán)血流減慢，胰腺微循環(huán)障礙［10］，使細(xì)胞因子和血管性介質(zhì)進(jìn)一步釋放，后者反過(guò)來(lái)又使微血管內(nèi)皮受更大的損傷，形成惡性循環(huán)。由于胰腺小葉結(jié)構(gòu)的特征決定了胰腺對(duì)缺血性損傷的高度敏感性，因此AP病變發(fā)展中，ET產(chǎn)生過(guò)多，NO生成相對(duì)不足，ET與NO平衡失調(diào)，使胰腺處于持續(xù)缺血狀態(tài)，胰腺微循環(huán)發(fā)生障礙，這可能是AP病變進(jìn)展的重要因素之一。

3.2 葛根素在急性胰腺炎中的作用

已有報(bào)告葛根素可以改善微循環(huán)，抑制氧自由基的產(chǎn)生，主要應(yīng)用于心腦血管疾病的治療［11，12］。葛根素具有糾正ET和 NO 失衡，改善內(nèi)皮功能的作用。葛根素可通過(guò)改善血循環(huán)狀態(tài)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能有保護(hù)作用，調(diào)節(jié)ET、NO代謝失衡狀況，從而調(diào)節(jié)血管舒縮功能［13］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，葛根素能使高血壓和不穩(wěn)定型心絞痛患者的ET顯著下降，NO水平顯著升高。其作用機(jī)理可能是:①葛根素可擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，增加組織灌注，改善微循環(huán)，使內(nèi)皮細(xì)胞的供氧量增加;②使氧自由基生成減少，增加其清除率;③降低血粘度，減輕損傷，內(nèi)皮功能改善后，合成和釋放的NO增加，而ET合成減少。葛根素廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的治療，但對(duì)AP的相關(guān)報(bào)道少見(jiàn)。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示葛根素治療組和AP組與SO組相比，血漿中ET和NO均升高，但是AP組中隨著病程演變ET與NO的比例逐漸失調(diào)，ET增加水平比NO快，使得病程后期ET的縮血管作用占主要地位，因此胰腺損傷較重。而葛根素治療組血清ET/NO比值與SO組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)，胰腺組織損傷較輕。表明了葛根素能使血漿中NO水平升高，以抗衡升高的ET的縮血管作用，糾正了ET和NO代謝失衡，從而改善了胰腺組織的血循環(huán)狀態(tài)，減輕胰腺組織的損傷。

葛根素能使急性胰腺炎大鼠血漿中NO水平增高，以抗衡ET的縮血管作用，從而改善胰腺微循環(huán)，降低胰腺組織的損傷。

［1］Liu TH，Kwong KL，Tamm EP，et al.Acute pancreatitis in intensive care unit patients:value of clinical and radiologic prognosticators at predicting clinical course and outcome［J］.Crit Care Med，2003，31(4):1026

［2］Lempinen M，Stenman UH，Halttunen J，et al.Early sequential changes in serum marks of acute pancreatitis induced by endoscopic retrograde cholangiopancreatography［J］.Pancreatology，2005，5(2-3):157

［3］Plusczyk T，Bersal B，Menger MD，et al.Differential effects of ET-1，ET-2 and ET-3 on pancreatic microcirculation，tissue integrity，and inflammation［J］.Dig Dis Sci，2001，46(6):1343

［4］Cosen-Binker LI，Binker MG，Cosen R，et al.Influence of nitric oxide-donating nonsteroidal anti-inflammatory drugs on the evolution of acute pancreatitis［J］.Shock，2006，25(2):190

［5］Sevillano S，de la Mano AM，Manso MA，et al.N-acetylcysteine prevents intra-acinar oxygen free radical production in pancreatic duct obstruction-induced acute pancreatitis［J］.Biochim Biophys Acta，2003，1639(3):177

［6］陳冰，李毅，高悅.葛根素對(duì)缺氧損傷的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和功能的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2009，15(4):72

［7］Zhao YC，Wei HJ，Duan Y.et al.Plasma interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha in patients with severe infection［J］.Chin Infect Chemother，2003，3(5):3l5

［8］Schmidt J，Rattner DW，Lewandrowski K，et al.A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy［J］.Ann Surg，1992，215:44

［9］Zhou ZG，Chen YD.Influencing factors of pancreatic microcirculartory impairmentin acute pancreatitis［J］.World J Gastroenterol，2002，8(3):406

［10］Plusczyk T，Bersal B，Menger MD，et al.Differential effects of ET-1，ET-2，and ET-3 on pancreatic microcirculation，tissue integrity，and inflammation［J］.Dig Dis Sci，2001，46(6):1343

［11］Granger J，Remick D.Acute pancreatitis:models，markers，and mediators［J］.Shock，2005:24(Supple 1):45

［12］高鵬，夏成青，王佩燕.葛根素對(duì)全腦缺血再灌注后腦組織誘導(dǎo)型一氧化氮合酶影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華急診醫(yī)學(xué)，2001，10(2):85

［13］袁林，苗蓁蓁，趙萍，等.葛根素對(duì)高血壓缺血性腦卒中中血ET-1，SOD，MAD的影響［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2000，9(22):2197