趙辛元，李偉民，李彩蓉，余亞娟

(咸寧學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院內(nèi)科學(xué)教研室，湖北 咸寧 437100)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病的最常見的微血管并發(fā)癥，大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)糖尿病腎病存在新生血管生成，而缺氧時(shí)微血管病變對(duì)腎臟疾病進(jìn)展起著重要作用。低氧促進(jìn)展的作用主要通過低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)/低氧反應(yīng)元件(HRE)途徑［1］。持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)HIF-1α的基因敲除小鼠腎臟纖維化加重，提示HIF-1α是一個(gè)新的調(diào)節(jié)腎臟纖維化因子［2］。因此，研究DN大鼠腎臟中HIF-1α表達(dá)的變化，明確低氧與糖尿病微血管并發(fā)癥的相關(guān)性，對(duì)有效防治和(或)延緩DN具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

動(dòng)物為清潔級(jí)近交系雄性Wister大鼠30只，體質(zhì)量180～210g(由湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供);主要試劑為HIF-1α兔抗小鼠多克隆抗體(ZYMED LABORATORIES公司)。

1.2 糖尿病腎病大鼠模型的建立

清潔級(jí)近交系雄性Wister大鼠30只，每籠5只，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境，12h光照周期。隨機(jī)分為糖尿病模型組和正常對(duì)照組，每組15只。糖尿病模型組給予單次左下腹腔注射60mg/kg的鏈尿佐菌素(STZ)，注射后第3d測(cè)尾靜脈血糖，若血糖低于＜11.1mmol/L者被排除;正常對(duì)照組腹腔注射等量的檸檬酸緩沖液，所有動(dòng)物于8周處死。

1.3 標(biāo)本采集

于實(shí)驗(yàn)第8周麻醉后剪斷頸動(dòng)脈取全血6～8ml，離心分離血清，待測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。并處死動(dòng)物，迅速取出腎臟，待檢。處死前夜大鼠禁食過夜，自由飲水。

1.4 觀察指標(biāo)

①生化檢測(cè):BUN、Scr采用Beckmam全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定，并計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率;血糖測(cè)定采用美國(guó)羅氏公司血糖測(cè)定儀。②腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察:石蠟包埋腎組織切片行HE染色，在光鏡下觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)改變。③免疫組化檢測(cè)腎臟組織HIF-1α:采用SP法檢測(cè)HIF-1α蛋白按SP法試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，結(jié)果以同濟(jì)千屏HPIAS2000型圖像分析軟件半定量分析。光鏡下HIF-1α表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核，以黃色、棕色、棕褐色為陽(yáng)性表達(dá)，其表達(dá)結(jié)果由染色細(xì)胞評(píng)判:分別隨即觀察每例高倍鏡(×400)下5個(gè)視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)百分比。④Western Blot檢測(cè):考馬斯亮蘭法測(cè)定各樣品蛋白質(zhì)含量，Western Blot分析HIF-1α的表達(dá)，免疫印跡條帶IOD值最后用Gel-Pro Analyzer3.1圖像分析系統(tǒng)分析。其相對(duì)含量分別用其與β-actin吸光度×面積之比值表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 生化指標(biāo)

糖尿病組大鼠的血糖、內(nèi)生肌酐清除率、尿素氮水平均較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，見表1。

表1 兩組大鼠生化指標(biāo)比較()

表1 兩組大鼠生化指標(biāo)比較()

與對(duì)照組比較，*P＜ 0.05;＊＊P＜ 0.01

組別 BUN(mmol/L) Scr(μmol/L) Ccr(ml/min) GLU(mmol/L)6.18 ±0.29 13.78 ±1.98 28.84 ±1.56 5.46 ±0.34糖尿病組 24.56±2.34＊＊ 33.58 ±2.76＊＊ 8.40 ±1.57＊＊ 19.87±3.15對(duì)照組*

2.2 HIF-1α 免疫組化表達(dá)

免疫組化顯示HIF-1α在糖尿病大鼠腎臟皮質(zhì)小管和皮髓之交界處腎小管上皮細(xì)胞核表達(dá)明顯增加，其陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增加，與對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，見表2。

2.3 HIF-1α 蛋白 Western Blot表達(dá)

糖尿病大鼠模型組HIF-1α的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，見表2。

表2 兩組大鼠腎臟組織中HIF-1α蛋白表達(dá)()

表2 兩組大鼠腎臟組織中HIF-1α蛋白表達(dá)()

與對(duì)照組比較，*P＜ 0.05;＊＊P＜ 0.01

0.005 ±0.001 0.087 ±0.007糖尿病組 0.236 ±0.020* 2.354 ±0.960-actin對(duì)照組組別 HIF-1α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)HIF-1α蛋白/β＊＊

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病最常見的致死、致殘的并發(fā)癥之一，本實(shí)驗(yàn)采用STZ成功建立了1型糖尿病大鼠模型，糖尿病大鼠組血糖顯著升高、腎功能損害，顯微鏡下可見腎小球基底膜增厚、系膜基質(zhì)增加，系膜區(qū)明顯擴(kuò)寬，部分毛細(xì)血管塌陷，符合糖尿病腎病的病理特點(diǎn)，提示實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠腎臟損傷模型成功建立。HIF-1α是細(xì)胞和組織在缺氧狀態(tài)下的主要調(diào)節(jié)因子，研究證明，HIF-1α參與調(diào)節(jié)缺氧相關(guān)基因的表達(dá)，減輕缺氧對(duì)機(jī)體造成的損傷;可以在缺氧狀態(tài)下多種組織細(xì)胞中表達(dá)，如腎、肝、腦、肺、心和視網(wǎng)膜組織，是缺氧狀態(tài)下許多細(xì)胞發(fā)生糖分解和新生血管形成的關(guān)鍵因素［3］。我們通過免疫組化和westerblot檢測(cè)了大鼠腎臟組織中HIF-1α的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在糖尿病模型組，HIF-1α蛋白表達(dá)明顯增加，提示HIF-1α參與糖尿病腎臟微血管病變的發(fā)生發(fā)展。但是HIF-1α參與微血管病變的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

［1］Takiyama Y，Harumi T，Watanabe J，et al.Tubular injury in a rat model of type 2 diabetes is prevented by metformin:a possible role of HIF-1α expression and oxygen metabolism［J］.Diabetes，2011，60(3):981

［2］Katavetin P，Miyata T，Inagi R，er al.High glucose blunts vascular endothelial growth factor response to hypoxia via the oxidative stress-regulated hypoxia-inducible factor/hypoxia-responsible element pathway［J］.J Am Soc Nephrol，2006，17(5):1405

［3］Sumual S，Saad S，Tang O，et al.Differential regulation of Snail by hypoxia and hyperglycemia in human proximal tubule cells［J］.Int J Biochem Cell Biol，2010，42(10):1689