苗 莉，羅先潤，景 濤，張 輝，劉安豐，婁云霄，何國祥

0 引 言

近來研究發(fā)現(xiàn)AT2R對細(xì)胞的增殖、遷移具有負(fù)性影響，局部導(dǎo)入使其表達(dá)增強(qiáng)可顯著減輕血管損傷后新生內(nèi)膜的面積［1－2］，但導(dǎo)入體內(nèi)基因的表達(dá)能否被實時、定量的控制在臨床治療中甚為重要。最近幾年已有一系列人工控制系統(tǒng)出現(xiàn)，其中四環(huán)素可調(diào)節(jié)系統(tǒng)(Tet-on)具有嚴(yán)密開/關(guān)的基因誘導(dǎo)表達(dá)作用，并且高效無毒，已被成功應(yīng)用于部分細(xì)胞中基因的誘導(dǎo)表達(dá)研究［3］。本研究在前期工作中通過引入四環(huán)素可調(diào)節(jié)系統(tǒng)，獲得了Dox可調(diào)控表達(dá)AT2R的大鼠MSC［4］，將其作為載體導(dǎo)入大鼠頸動脈球囊損傷動物模型中，進(jìn)一步探討AT2R在體可調(diào)控表達(dá)對血管損傷后新生內(nèi)膜的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與動物 MSC由大鼠下肢骨髓中密度梯度離心法獲得并常規(guī)培養(yǎng);受Dox調(diào)控表達(dá)AT2R基因MSC由本實驗室前期工作中轉(zhuǎn)染、篩選獲得，經(jīng)RT-PCR及Western印跡雜交檢測鑒定該MSC系低背景、高誘導(dǎo)表達(dá)AT2R基因［4］。健康成年雄性SD大鼠59只，SPF級，體重380～450 g，飼養(yǎng)溫度18～26℃，光照為每天12 h，飼養(yǎng)清潔級大鼠顆粒飼養(yǎng)，自由取食。質(zhì)量合格證號:SCXK軍2002-007，由第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。DAPI(美國Roche公司);兔抗AT2R多克隆抗體(美國Santa Cruz公司);直徑2.0 mm經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)球囊導(dǎo)管(美國Cordis公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立大鼠頸動脈球囊損傷模型 大鼠腹腔內(nèi)注射戊巴比妥(30 mg/kg)麻醉，取頸正中切口，從頸外靜脈注射肝素鈉100 U/kg，從左頸外動脈切口處插入直徑2.0 mm球囊導(dǎo)管至左頸總動脈，以1.5 atm大氣壓(1 atm=101.325 kPa)充盈球囊，來回抽動3次以剝脫內(nèi)皮，撤出球囊及導(dǎo)引鋼絲，用灌注管向損傷節(jié)段內(nèi)注入相應(yīng)的MSC懸液50μl(細(xì)胞密度:1×104/ml)或PBS，留置30 min后，再經(jīng)頸動脈注射肝素鈉100 U/kg，結(jié)扎頸外動脈，恢復(fù)頸總動脈至頸內(nèi)動脈血流，縫合切口。

1.2.2 實驗分組 SD大鼠隨機(jī)分為正常組6只大鼠(未進(jìn)行球囊擴(kuò)張)，對照組(球囊擴(kuò)張后注入PBS)、MSC組(球囊擴(kuò)張后導(dǎo)入常規(guī)培養(yǎng)的MSC)、MSC轉(zhuǎn)染組(球囊擴(kuò)張后導(dǎo)入轉(zhuǎn)染AT2R的MSC，未給予Dox)、Dox組(球囊擴(kuò)張后導(dǎo)入轉(zhuǎn)染AT2R的MSC，于術(shù)后當(dāng)天開始至處死前3 d，每天尾靜脈注射Dox 100μg/kg)，每組12只大鼠，分別于術(shù)后14、28 d處死取材，各時相點每組6只大鼠，另取5只大鼠導(dǎo)入DAPI熒光標(biāo)記的MSC作為熒光示蹤檢查。

1.2.3 頸動脈新生內(nèi)膜增生的檢測 石蠟切片HE染色，光鏡下觀察血管內(nèi)膜增生情況，用Image pro plus 6.0計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測量內(nèi)膜、中膜面積，并計算內(nèi)膜/中膜面積比(I/M)。

1.2.4 熒光標(biāo)記示蹤 熒光標(biāo)記組大鼠于術(shù)后4 d處死，取出手術(shù)的血管段及對側(cè)未手術(shù)的頸動脈，修剪外膜，PBS反復(fù)沖洗后置入4%多聚甲醛中固定30 min，然后將血管縱向剪開，平鋪在載玻片上，鋪上蓋玻片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.5 免疫組化分析檢測AT2R 常規(guī)脫蠟至水，枸鹽酸鹽緩沖液95℃抗原修復(fù)30 min。封閉非特異性結(jié)合位點，加入兔抗AT2R(稀釋度為1∶100)4℃孵育過夜。PBS洗5 min×3次，滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃孵育30 min。PBS洗5 min×3次，滴加 SABC工作液，37℃孵育30 min。PBS洗5 min×3次，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。脫水、透明、樹膠封片。光鏡下觀察，用Image pro plus 6.0圖像分析系統(tǒng)半定量分析。

1.2.6 RT-PCR 檢測血管中AT2R的mRNA表達(dá)用Tripure(美國Promega公司)一步法提取組織總RNA，取10μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再取1μg逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。AT2R(707 bp)反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s，52℃退火1 min，72℃延伸30 s，共30個循環(huán);72℃再延伸10 min。AT2R引物序列:正義5'-TGA TAA TCT CAA CGC AAC TGG-3'和反義 5'-TCA AGA CTT GGT CAC GGG TAA-3'。以三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH，452 bp)的PCR作為內(nèi)參照。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析。

2 結(jié) 果

2.1 MSC移植后在血管腔面熒光示蹤結(jié)果 術(shù)后4 d，熒光標(biāo)記組大鼠手術(shù)的血管段在激光共聚焦顯微鏡下觀察，可見帶有藍(lán)色熒光的MSC生長于血管腔面，而未損傷的右側(cè)頸總動脈內(nèi)膜未見有藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)胞。

2.2 計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)檢測各組動脈內(nèi)膜和中層面積 正常組大鼠頸總動脈內(nèi)膜面光滑，單層內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋整個管腔，無新生內(nèi)膜增生;在損傷后14～28 d，對照組、MSC組、MSC轉(zhuǎn)染組新生內(nèi)膜增生明顯，造成明顯的管腔狹窄，3組間新生內(nèi)膜面積無顯著差異(P＞0.05);Dox組亦可見有新生內(nèi)膜增生，但程度較其他各損傷組顯著減輕，其I/M較對照組、MSC 組、MSC 轉(zhuǎn)染組顯著降低(P ＜0.01)，見表1、圖1。

表1 大鼠頸總動脈新生內(nèi)膜和中膜測量結(jié)果(s)Table 1 The neointima and media area in rat carotid arteries±s)

表1 大鼠頸總動脈新生內(nèi)膜和中膜測量結(jié)果(s)Table 1 The neointima and media area in rat carotid arteries±s)

與對照組、MSC組和MSC轉(zhuǎn)染組比，*P＜0.01

組 別 n I/M對照組 12 0.31 ±0.07 0.22 ±0.04 1.43 ±0.24 0.43 ±0.05 0 14 d內(nèi)膜(mm2) 中膜(mm2)I/M28 d內(nèi)膜(mm2) 中膜(mm2).24 ±0.02 1.79 ±0.29 MSC 組 12 0.32 ±0.06 0.23 ±0.04 1.39 ±0.20 0.44 ±0.04 0.24 ±0.03 1.83 ±0.18 MSC 轉(zhuǎn)染組 12 0.30 ±0.07 0.21 ±0.03 1.43 ±0.21 0.41 ±0.05 0.23 ±0.03 1.77 ±0.23 Dox組 12 0.18 ±0.02 0.22 ±0.03 0.81 ±0.11* 0.25 ±0.02 0.23 ±0.02 1.08 ±0.11*

圖1 大鼠頸動脈損傷后4周各組血管內(nèi)膜增生情況(HE×100)Figure 1 Neointim a of the carotid arteries at 4 week after injury(HE×100)

2.3 動脈壁AT2R蛋白表達(dá)分析 免疫組化結(jié)果顯示，正常組未見AT2R表達(dá)，在損傷后14 d時，對照組、MSC組、MSC轉(zhuǎn)染組在動脈壁的內(nèi)膜、中膜及外膜有少量AT2R表達(dá)，3組間相比AT2R的表達(dá)無明顯差異(P＞0.05)，而Dox組新生內(nèi)膜中 AT2R的表達(dá)顯著高于其他手術(shù)組(P＜0.01);損傷后28 d時各組血管壁中AT2R的表達(dá)較14 d時均有所降低，對照組、MSC組、MSC轉(zhuǎn)染組3組間相比AT2R的表達(dá)無明顯差異(P＞0.05)，Dox組AT2R蛋白表達(dá)仍顯著高于其他手術(shù)組(P＜0.01)，見表2。

表2 動脈壁AT2R蛋白表達(dá)的圖像分析結(jié)果(A值，s)Table 2 The expression of AT2R protein in rat carotid arteries(A value，s)

表2 動脈壁AT2R蛋白表達(dá)的圖像分析結(jié)果(A值，s)Table 2 The expression of AT2R protein in rat carotid arteries(A value，s)

與對照組、MSC組和MSC轉(zhuǎn)染組比，*P＜0.01

時間(d)正常組(n=6)對照組(n=12)MSC組(n=12)MSC轉(zhuǎn)染組(n=12)Dox組(n=12)14 0 47.62±12.11 52.22±9.08 50.76±10.42 88.20±21.39*28 0 37.12±9.50 38.78±5.76 41.50±9.98 85.67±19.88*

2.4 RT-PCR檢測AT2R mRNA表達(dá) 正常組動脈壁中無AT2R mRNA的表達(dá)，在球囊損傷后14 d時，對照組、MSC組和MSC轉(zhuǎn)染組均有少量表達(dá)，28 d時表達(dá)下降，3組間比較無差異(P＞0.05)，Dox組在損傷后14 d時AT2R mRNA的表達(dá)水平顯著高于其他各組(P＜0.01)，28 d時仍維持較強(qiáng)表達(dá)(P ＜0.01)，見圖2、圖3。

圖2 各組血管AT2R mRNA表達(dá)的比較Figure 2 Com parison of the expression of AT2R mRNA among five groups

圖3 各組頸動脈AT2R m RNA表達(dá)的RT-PCR分析Figure 3 The RT-PCR analysis of AT2R mRNA in the carotid arteries

3 討 論

對轉(zhuǎn)入體內(nèi)的外源基因根據(jù)治療的需要進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)控，是轉(zhuǎn)基因治療中的關(guān)鍵問題［5］。在臨床應(yīng)用中根據(jù)疾病的特點來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)，使基因表達(dá)產(chǎn)物的濃度控制在一定的表達(dá)水平上，并帶來最佳的治療效果，是我們對轉(zhuǎn)基因治療最大的期望。在通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使AT2R基因于血管局部表達(dá)增強(qiáng)，從而達(dá)到抑制新生內(nèi)膜過度增殖的研究時，應(yīng)考慮治療基因如被自身啟動子自發(fā)激活，使之過度表達(dá)或不適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)，不僅對治療不利，還可能產(chǎn)生嚴(yán)重的后果。

經(jīng)過前期2個回合的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及嚴(yán)格篩選，我們獲得了受到Dox調(diào)控的穩(wěn)定表達(dá)AT2R基因的MSC細(xì)胞系。該細(xì)胞系平時不表達(dá)AT2R基因，而給予Dox后可在48 h內(nèi)顯著表達(dá)，并且8周內(nèi)無明顯改變。本實驗將該MSC系導(dǎo)入大鼠頸動脈損傷模型，術(shù)后4 d取注入4，6-二乙?；?2-苯基吲哚熒光標(biāo)記MSC的血管，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)在血管腔面有細(xì)胞核發(fā)藍(lán)色熒光的細(xì)胞，表明輸入的MSC于血管損傷處黏附、生長。研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮損傷后14、28 d時，各手術(shù)組均出現(xiàn)增殖的新生內(nèi)膜及AT2R的表達(dá)，其中Dox組大鼠血管內(nèi)膜AT2R的表達(dá)水平顯著高于對照組、MSC組及MSC轉(zhuǎn)染組，并且血管內(nèi)膜增生較其他3組顯著減輕;MSC組、MSC轉(zhuǎn)染組和對照組AT2R基因的表達(dá)情況無明顯差異，3組損傷血管均可見到明顯增生的新生內(nèi)膜，并導(dǎo)致較重的管腔狹窄，3組間I/M無顯著差異。該結(jié)果提示表達(dá)AT2R基因的MSC在帶入局部AT2R基因的同時，AT2R基因的表達(dá)與否受到了Dox的良好調(diào)控，通過外用藥物的使用使AT2R基因表達(dá)顯著增高，可有效地抑制血管損傷后新生內(nèi)膜的過度增生。

本實驗結(jié)果還表明，MSC可能參與了球囊損傷后血管新生內(nèi)膜的形成，但是對其增生程度及最終管腔面積的形成無明顯影響。結(jié)合既往研究推測［6－7］，在血管內(nèi)皮損傷后，MSC 可黏附于血管壁并與暴露的中膜血管平滑肌細(xì)胞接觸，在局部微環(huán)境的作用下部分MSC可能向血管平滑肌細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞分化，雖然可能暫時造成了血管平滑肌細(xì)胞的增多，但同時由于加速了血管內(nèi)皮化的的進(jìn)程對內(nèi)膜的增生起到了拮抗作用，最終并不影響血管內(nèi)膜的形成。該結(jié)論與2004年Wollert等［8］研究結(jié)果相一致，認(rèn)為骨髓單個核細(xì)胞移植不增加介入術(shù)后再狹窄的發(fā)生率，并且與近期部分對MSC的離體或在體的研究結(jié)果相一致［9－10］。

MSC具有多向分化潛能［11－12］，以及容易通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得目標(biāo)基因并在體內(nèi)外長期表達(dá)，且取材方便，不存在組織配型及免疫排斥問題，是基因治療中接受目標(biāo)基因的優(yōu)秀載體細(xì)胞［13－14］。本實驗通過已建立的Dox可調(diào)控的表達(dá)AT2R的MSC為載體，首次進(jìn)行了AT2R基因在體可調(diào)控表達(dá)抑制血管損傷后新生內(nèi)膜形成的研究，為今后利用基因技術(shù)進(jìn)行再狹窄的防治提供了新的思路及理論基礎(chǔ)。

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