孫 琤，張 苗，蔣春明

0 引 言

PD是終末期腎病患者常用的替代治療方法之一。但長期PD后腹膜會發(fā)生纖維化，導致透析效能下降［1－2］。MMP-2及 TIMP-1失衡可導致細胞外基質沉積，是組織纖維化包括腹膜組織纖維化發(fā)生發(fā)展的重要機制之一［3－4］。近年來的研究表明，丹參酮ⅡA對多種細胞具有抑制MMP-2和增強TIMP-1表達的作用，但其在PD相關纖維化的作用尚無研究報道。本文首先通過體外實驗觀察丹參酮ⅡA對人腹膜間皮細胞增殖活性及其表達MMP-2、TIMP-1的影響，并在臨床上觀察PDS中添加丹參酮ⅡA對腹腔局部MMP-2及TIMP-1的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 2.5%Baxter PDS為廣州百特醫(yī)療用品公司產品;丹參酮ⅡA注射液為上海第一生化藥業(yè)有限公司產品，規(guī)格10mg/支;磷酸鹽緩沖液(PBS)、胎牛血清(FBS)、RPMI1640粉劑以及胰蛋白酶等購自GIBCO公司;抗細胞角蛋白抗體、抗波形蛋白抗體、第八因子抗體和抗白細胞CD45抗體購自北京中山生物技術有限公司;完全培養(yǎng)基為含20%FBS和105U/L青霉素及100 pg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液;MMP-2、TIMP-1 ELISA檢測試劑盒購自上海普林斯頓生物科技發(fā)展有限公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲亞砜(DMSO)為Sigma公司產品;全自動酶標儀(Sunrise)為Biobank公司產品;RT-PCR試劑盒購自 Takara公司;MMP-2、TIMP-1和β-actin引物購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 人腹膜間皮細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定 取6例非尿毒癥和非糖尿病擇期手術患者的網膜作為間皮細胞來源，按文獻［5］方法培養(yǎng)人腹膜間皮細胞。當細胞生長融合成單層時，用0.25%胰蛋白酶——0.02%EDTA 消化，按 1∶3 傳代，第 3 代用于實驗。傳代細胞經倒置顯微鏡觀察和免疫組化抗細胞角蛋白抗體、抗波形蛋白抗體染色陽性，抗第八因子抗體和抗白細胞CD45抗體染色陰性鑒定證實。

1.2.2 MMP-2、TIMP-1及細胞增殖活力檢測 用含20%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，將第2代消化細胞重懸成1×105/ml的細胞懸液，置96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，每孔200μl，當細胞融合度達到80%左右時，用含0.1%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液同步24 h后分5組觀察，每組設2復孔。對照組為加入RPMI l640與完全培養(yǎng)基各100μl，PDS組為加入PDS與完全培養(yǎng)基各100μl;丹參酮ⅡA 1mg/L組、丹參酮ⅡA 5 mg/L組、丹參酮ⅡA 10 mg/L組分別含丹參酮ⅡA的PDS與完全培養(yǎng)液各100μl，丹參酮ⅡA終濃度分別為1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L;37 ℃，5%CO2培養(yǎng)48 h后上清液－20℃保存，按ELISA試劑盒說明檢測MMP-2、TIMP-1。完全培養(yǎng)基100μl和濃度為5 mg/ml的MTT 100μl加入培養(yǎng)孔中繼續(xù)孵育3 h，棄上清液，每孔加入 DMSO 200μl震蕩混勻，取100μl加入96孔板，在492 nm處測吸光度(A)值，以A值表示人腹膜間皮細胞活性。

1.2.3 半定量RT-PCR 使用T75培養(yǎng)瓶進行細胞培養(yǎng)，分組同1.2.2，丹參酮ⅡA干預48 h后收集培養(yǎng)細胞，Trizol法抽提RNA。3μl總RNA進行逆轉錄合成cDNA。引物序列見表1。PCR循環(huán)參數:95℃預變性30 s，95℃ 30 s，62℃ 90 s，72℃ 1min，共30個循環(huán)，72℃延伸4 min。取擴增產物10μl，在TAE緩沖液中行1.0%瓊脂糖凝膠(含5 g/l溴化乙錠)電泳。應用全自動圖像分析系統(tǒng)對電泳圖像進行A值掃描，以β-actin條帶為內參照，計算MMP-2、TIMP-l mRNA的相對表達量。

1.2.4 臨床試驗 自2008年6月起，對置管透析3～6個月的38例患者進行為期6周的前瞻性觀察，其中男23例，女15例，年齡28～83歲，平均年齡(52.6±14.3)歲。原發(fā)病包括慢性腎小球腎炎17例，高血壓腎小動脈硬化15例，梗阻性腎病3例，痛風性腎病、多囊腎、不明原因各1例。所有參與患者均簽署知情同意書。將38例患者隨機分成實驗組和對照組，每組19例。入組條件包括;①無糖尿病、腫瘤、系統(tǒng)性血管炎等全身性疾病病史;②無長期吸煙史;③觀察期前1個月未發(fā)生腹膜炎、其他顯性感染及心力衰竭等并發(fā)癥。排除標準包括:①觀察期內發(fā)生腹膜炎、其他顯性感染及心力衰竭等并發(fā)癥;②觀察期內出現藥物種類或藥物劑量調整。觀察方案為:第1天用2.5%Baxter PDS，留取4 h透出液1管，于30 min內分離上清液(3000×g離心10 min)，置－70℃冰箱凍存，2周內使用ELISA法檢測透出液MMP-2、TIMP-1的含量。其后3周，實驗組患者給予含丹參酮ⅡA注射液(10 mg/2L)的1.5%Baxter PDS，行標準持續(xù)非臥床PD(2 L×4次交換/d)治療;對照組不給藥。第3周末重復檢測上述指標;隨后3周，2組患者均不給藥，在第6周末重復檢測上述指標。

1.3 統(tǒng)計學分析 用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析。定量資料用均數±標準差±s)表示，組內自身前后比較用配對t檢驗，組間比較用單因素方差分析，兩兩組間比較采用SNK檢驗。以P≤0.05為差異有顯著性統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 體外實驗

2.1.1 人腹膜間皮細胞增殖活性的改變 培養(yǎng)的人腹膜間皮細胞經PDS干預后，其MTT還原能力(A值)顯著低于對照組(P＜0.01)。再經丹參酮ⅡA干預后，丹參酮ⅡA 1 mg/L組、5 mg/L組、10 mg/L組人腹膜間皮細胞MTT還原能力(A值)顯著高于PDS組(P＜0.05)。丹參酮ⅡA 1 mg/L組、5 mg/L組、10 mg/L組組間比較，丹參酮ⅡA 5 mg/L組人腹膜間皮細胞增殖活性顯著高于丹參酮ⅡA 1 mg/L組(P＜0.05)，丹參酮ⅡA 10 mg/L組顯著高于丹參酮ⅡA 5 mg/L組(P＜0.05)。結果見表2。

表1 MMP-2、TIMP-1、β-actin引物序列及PCR反應條件Table 1 Primer sequences and PCR conditions of MMP-2，TIMP-1 and β-actin

表2 不同劑量丹參酮ⅡA對人腹膜間皮細胞產生MMP-2、TIMP-1及增殖活性的影響(s)Table 2 Effects of TanshinoneⅡA on cell proliferation activity and secretion of MMP-2 and TIMP-1 of HPMCs(s)

表2 不同劑量丹參酮ⅡA對人腹膜間皮細胞產生MMP-2、TIMP-1及增殖活性的影響(s)Table 2 Effects of TanshinoneⅡA on cell proliferation activity and secretion of MMP-2 and TIMP-1 of HPMCs(s)

與對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與 PDS組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與丹參酮ⅡA 1 mg/L 組比較，△P ＜0.05;與丹參酮ⅡA 5 mg/L組比較，▲P ＜0.05

組 別 n MMP-2(ng/ml) TIMP-1(ng/ml) MMP-2/TIMP-1 61.4 ±23.4 22.2 ±14.6 4.07 ±2.61 PDS 組 6 139 ±44.9* 27.5 ±19.2 7.17 ±3.13*丹參酮ⅡA 1mg/L 組 6 130 ±39.5## 38.5 ±20.7 3.95 ±1.27#丹參酮ⅡA 5 mg/L 組 6 113±28.0##△ 40.8±21.4 3.34 ±1.30##△丹參酮ⅡA 10 mg/L 組 6 106±27.8##▲ 43.4±22.2#△▲ 2.89 ±1.18##▲對照組6 A值0.39 ±0.09 0.18 ±0.07＊＊0.30 ±0.07##0.35 ±0.08##△0.37 ±0.08##▲

2.1.2 人腹膜間皮細胞產生MMP-2、TIMP-1的變化 培養(yǎng)的人腹膜間皮細胞經PDS及丹參酮ⅡA使用后，上清液中 MMP-2、TIMP-1的含量及MMP-2/TIMP-1比值的變化見表2。PDS組上清液MMP-2含量較對照組明顯增高(P＜0.05)，TIMP-1含量無明顯變化，MMP-2/TIMP-1比值明顯增加(P＜0.05);添加丹參酮ⅡA干預后的丹參酮ⅡA 1 mg/L組、5 mg/L組、10 mg/L組 MMP-2含量顯著低于PDS組(P＜0.01)，丹參酮ⅡA 10 mg/L組TIMP-1含量顯著高于 PDS組(P＜0.05)，MMP-2/TIMP-1比值顯著低于PDS組(P＜0.05)。丹參酮ⅡA 1 mg/L組、5 mg/L組、10 mg/L組組間比較，丹參酮ⅡA 5 mg/L組MMP-2顯著低于丹參酮ⅡA 1 mg/L組(P＜0.05)，丹參酮ⅡA 10 mg/L組顯著低于丹參酮ⅡA 5 mg/L組(P＜0.05);丹參酮ⅡA 10 mg/L組TIMP-1顯著高于丹參酮ⅡA 1 mg/L組、5 mg/L組(P ＜0.05);丹參酮ⅡA 5 mg/L組MMP-2/TIMP-1比值顯著低于丹參酮ⅡA 1 mg/L組(P＜0.05)，丹參酮ⅡA 10 mg/L組顯著低于丹參酮ⅡA 5 mg/L組(P＜0.05)。

2.1.3 人腹膜間皮細胞 MMP-2、TIMP-1 mRNA的表達 與對照組比較，PDS組人腹膜間皮細胞MMP-2/β-actin mRNA 和 TIMP-1/β-actin mRNA 分別上升(2.36 ±0.60)倍(P ＜0.01)和(1.13 ±0.10)倍(P ＞0.05);與 PDS組相比，丹參酮ⅡA 1 mg/L組、5 mg/L組、10 mg/L組人腹膜間皮細胞MMP-2/β-actin mRNA表達水平均顯著下調(P＜0.01)，TIMP-1/β-actin mRNA 表達水平均有顯著上調(P ＜ 0.05)。結果見圖1、圖2。

2.2 臨床觀察 2組患者觀察期前后透出液MMP-2、TIMP-1結果見表3。實驗組患者用藥3周后，透出液MMP-2較用藥前明顯降低(P＜0.05)，透出液TIMP-1無明顯變化(P＞0.05)，停藥3周后，透出液MMP-2較用藥3周后明顯升高(P＜0.05)，透出液TIMP-1無明顯變化(P＞0.05);對照組患者觀察期前后透出液MMP-2、TIMP-1均無明顯變化(P＞0.05)。實驗組患者用藥過程中未出現皮膚發(fā)紅、瘙癢、肝功能異常、血細胞減少等不良反應［6］。

圖1 人腹膜間皮細胞MMP-2、TIMP-1 m RNA的表達Figure 1 Expressions of MMP-2 and TIMP-1 m RNA in different groups

圖2 人腹膜間皮細胞表達MMP-2、TIMP-1 m RNA的相對半定量分析Figure 2 Sem i-quantification of MMP-2 and TIMP-1 m RNA in HPMCs

表3 實驗組和對照組患者透出液MMP-2、TIMP-1的變化(s)Table 3 Changes of MMP-2 and TIMP-1 in the effluent of the experimental and control groups(±s)

表3 實驗組和對照組患者透出液MMP-2、TIMP-1的變化(s)Table 3 Changes of MMP-2 and TIMP-1 in the effluent of the experimental and control groups(±s)

與同組第1天比較，*P＜0.05;與同組第3周末比較，#P＜0.05

組 別 MMP-2(ng/ml)TIMP-1(ng/ml)周末對照組 51.8 ±24.5 50.9 ±23.6 51.2 ±25.5 52.3 ±25.4 51.第1天 第3周末 第6周末 第1天 第3周末 第6 5 ±24.3 53.3 ±26.7實驗組 122.8 ±45.1 112.9 ±47.1* 119.5 ±45.8#122.0 ±49.8 123.7 ±49.2 125.4 ±48.5

近年來研究證實，抑制MMP-2的活性可阻止腹膜結構和功能變化，并促使腹膜結構和功能的好轉。Ro等［12］發(fā)現，使用MMP拮抗劑ONO-4817可防止高糖腹透液引起的腹膜增厚、間皮下致密層新生血管的形成及巨噬細胞的浸潤等。Nishina等［13］使用中性 pH腹膜透析液降低了透出液MMP-2水平，避免腹膜超濾失敗。本研究通過體外實驗觀察到，在人腹膜間皮細胞培養(yǎng)液+PDS中再添加丹參酮ⅡA后，與PDS組比較，其上清液中MMP-2明顯減少，MMP-2/TIMP-1比值顯著降低，人腹膜間皮細胞表達MMP-2 mRNA顯著下調，且隨著丹參酮ⅡA濃度的升高，這種改善程度愈加明顯。此外，還觀察到人腹膜間皮細胞表達TIMP-1 mRNA顯著上調，并與丹參酮ⅡA濃度也呈量效關系。提示丹參酮ⅡA具有下調人腹膜間皮細胞MMP-2 mRNA表達、上調TIMP-1 mRNA表達，從而抑制PDS刺激間皮細胞產生MMP-2的作用，調節(jié)MMP-2/TIMP-1的平衡。進一步的體內研究顯示，實驗組腹腔使用丹參酮ⅡA3周后，透出液MMP-2明顯降低，而透出液TIMP-1無明顯變化，再經過3周的洗脫期后，透出液MMP-2又有明顯升高，并恢復至用藥前的水平;而對照組在整個觀察期前后透出液MMP-2、TIMP-1水平均無明顯變化。提示在PDS中添加丹參酮ⅡA可顯著降低PD患者腹腔內高MMP-2狀態(tài)。使用丹參酮ⅡA過程中，實驗組無明顯不良反應發(fā)生，證實其在腹腔內應用是安全可行的。

本研究結果還顯示，在PDS組，其間皮細胞增殖活性較對照組顯著降低，證實傳統(tǒng)PDS可抑制人腹膜間皮細胞的增殖活性。隨著在PDS中添加丹參酮ⅡA干預后，人腹膜間皮細胞增殖活性得到明顯改善，且改善程度呈現明顯的劑量依賴性，提示丹參酮ⅡA可拮抗PDS對人腹膜間皮細胞增殖活性的抑制作用，起到保護人腹膜間皮細胞的

3 討 論

PD作為一種主要的終末期腎病患者腎替代治療方法在臨床上廣泛應用，而生物不相容的傳統(tǒng)PDS引起腹膜組織損傷、過度重塑、腹膜增厚及硬化是腹膜功能衰竭、透析技術性失敗的病理學特征［2］。眾多研究發(fā)現，MMP/TIMP在上述過程中起關鍵作用，其中MMP-2作為一種明膠酶，可降解構成基底膜成分的膠原蛋白Ⅳ、纖維連接蛋白等細胞外基質，并可促進新生血管的生成、致纖維化細胞的遷移等［3］;TIMP-1則可抑制MMP-2造成的細胞外基質降解，維持與MMP-2的動態(tài)平衡。伴隨著腹腔內高水平的MMP-2及TIMP-1，腹膜循序漸進地出現炎癥、纖維性增厚等變化，最終導致硬化。因而，調節(jié)MMP/TIMP的平衡可能給減輕腹膜損傷、抑制重塑、延緩腹膜硬化的發(fā)生帶來益處。丹參酮ⅡA為丹參提取物，也是丹參有效的藥理成分之一，具有許多獨特的藥理作用［7］，近年來又被許多基礎研究證實，具有抑制多種細胞表達MMP-2 以及增加 TIMP-1 表達等作用［8－10］。因此，通過在體外培養(yǎng)條件下向培養(yǎng)液中添加不同濃度的丹參酮ⅡA，觀察其對人腹膜間皮細胞MMP-2、TIMP-1產生的影響，并通過在PD患者腹腔內使用丹參酮ⅡA，了解其對腹腔內 MMP-2、TIMP-1的影響。

PDS中高糖、低pH及高溫消毒過程中產生的葡萄糖降解產物，可誘導腹膜固有細胞包括間皮細胞 MMP-2及 TIMP-1的表達［11］。本研究亦證實，通過向人腹膜間皮細胞培養(yǎng)液中添加PDS后，與對照組比較，其上清液中MMP-2的含量顯著升高，MMP-2/TIMP-1比值明顯增加，人腹膜間皮細胞表達MMP-2 mRNA顯著上調，提示PDS具有刺激人腹膜間皮細胞產生MMP-2的作用，并通過調節(jié)MMP-2/TIMP-1的平衡，參與腹膜損傷的過程。作用。

綜上所述，丹參酮ⅡA可通過影響人腹膜間皮細胞MMP-2、TIMP-1 mRNA的表達，調節(jié)MMP-2/TIMP-1平衡，改善腹膜間皮細胞的增殖活性，顯著降低PD患者腹腔內高MMP-2狀態(tài)，起到潛在的保護腹膜間皮細胞和拮抗腹膜硬化的作用。

［1］Coester AM，Smit W，Struijk DG，et al.Peritoneal function in clinical practice:the importance of follow-up and its measurement in patients.Recommendations for patient information and measurement of peritoneal function［J］.NDT Plus，2009，2(2):104-110.

［2］Schmidt DW，Flessner MF.Pathogenesis and treatment of encapsulating peritoneal sclerosis:Basic and translational research［J］.Perit Dial Int，2008，28(Suppl 5):S10-S15.

［3］Hirahara I，Inoue M，Okuda K，et al.The potential of matrix metalloproteinase-2 as a marker of peritoneal injury，increased solute transport，or progression to encapsulating peritoneal sclerosis during peritoneal dialysis-a multicentre study in Japan［J］.Nephrol Dial Transplant，2007，22(2):560-567.

［4］Hirahara I，Inoue M，Umino T，et al.Matrix metalloproteinase levels in the drained dialysate reflect the peritoneal solute transport rate:A multicentre study in Japan［J］.Nephrol Dial Transplant，2011，26(5):1695-1701.

［5］Stylianou E，Jenner LA，Davies M，et al.Isolation，culture and characterization of human peritoneal mesothelial cells［J］.Kidney Int，1990，37(6):1563-1570.

［6］曹曉梅，陳小銘，孫維林.丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液的安全性評價［J］.醫(yī)學研究生學報，2010，23(5):474-476.

［7］黃 珮.腹膜透析液添加丹參酮對大鼠氧化應激狀態(tài)的影響［J］.醫(yī)學研究生學報，2010，23(8):818-821.

［8］蔣 平，陳 鳴，呂 軍，等.丹參酮ⅡA對阿爾茨海默病模型大鼠海馬MMP-2、iNOS表達及自由基釋放的影響［J］.第二軍醫(yī)大學學報，2010，31(4):380-384.

［9］楊東威，孟 彪，高立珍，等.丹參酮Ⅱa對佐劑性關節(jié)炎大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α水平及滑膜MMP3/TIMP1表達的影響［J］.實用中西醫(yī)結合臨床，2007，7(6):6-7，12.

［10］Fang ZY，Lin R，Yuan BX，et al.TanshinoneⅡA downregulates the CD40 expression and decreases MMP-2 activity on atherosclerosis induced by high fatty diet in rabbit［J］.J Ethnopharmacol，2008，115(2):217-222.

［11］Hirahara I，Kusano E，Yanagiba S，et al.Peritoneal injury by methylglyoxal in peritoneal dialysis［J］.Perit Dial Int，2006，26(3):380-392.

［12］Ro Y，Hamada C，Inaba M，et al.Inhibitory effects of matrix metalloproteinase inhibitor ONO-4817 on morphological alterations in chlorhexidine gluconate-induced peritoneal sclerosis rats［J］.Nephrol Dial Transplant，2007，22(10):2838-2848.

［13］Nishina M，Endoh M，Suzuki D，et al.Neutral-pH peritoneal dialysis solution improvesperitoneal function and decreases matrix metalloproteinase-2(MMP-2)in patients undergoing continuous ambulatory peritoneal dialysis(CAPD)［J］.Clin Exp Nephrol，2004，8(4):339-343.