楊湘越，張惠菊，徐秀云，蘭小鵬，朱忠勇

0 引 言

混合性結(jié)締組織病(mixed connective tissue disease，MCTD)是自身免疫性疾病的一種，臨床表現(xiàn)較復(fù)雜，可同時(shí)具有系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化癥、多發(fā)性肌炎、皮肌炎等疾病的表現(xiàn)，其診斷重要依據(jù)之一是血清中存在著高滴度的抗U1RNP抗體［1］?？筓1RNP抗體由抗U1RNP-70K抗體、抗U1RNP-A抗體和抗U1RNP-C抗體組成，3者可同時(shí)出現(xiàn)，也可單獨(dú)出現(xiàn)。有研究者發(fā)現(xiàn)幾乎所有MCTD患者早期都會(huì)出現(xiàn)抗U1RNP 70K抗體［2］。由于其靶抗原70K U1RNP蛋白的編碼基因GC含量高達(dá)70%以上，用普通Taq酶難以一步克隆。沈南等［3－4］將其分為2段分別克隆后再拼接成為完整的編碼基因，可在大腸桿菌中成功表達(dá)U1RNP 70K融合抗原。但原核系統(tǒng)在抗原的表達(dá)量、活性、包涵體變復(fù)性、純化、融合蛋白切割處理等方面存在諸多問(wèn)題。我們采用大連寶生物公司針對(duì)高GC含量及復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)目的基因克隆的高保真 Taq酶，克隆人U1RNP 70K基因，在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)真核系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)高分泌表達(dá)并建立了簡(jiǎn)便快速的斑點(diǎn)免疫金滲濾檢測(cè)法(dot immuogold filtration assay，DIGFA)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人白血病淋巴細(xì)胞HL-60 cDNA由福建省血液病研究所陳英玉惠贈(zèng)，大腸桿菌JM109、巴斯德畢赤酵母菌SMD1168(his4pep4)和酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9k為本室保存，各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、含GC的HS DNA聚合酶PCR擴(kuò)增試劑盒、pMD18-T載體、DL2000 DNA分子標(biāo)志物購(gòu)自大連寶生物有限公司，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自美國(guó)Generay Biotech上海公司，質(zhì)粒抽提和DNA回收試劑盒、G418、蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司，3S柱離心式酵母基因組制備試劑盒購(gòu)自上海申能博彩公司，小牛血清白蛋白(BSA)、生物素、酵母氮源(yeast nitrogen base，YNB)和硝酸纖維素膜購(gòu)自上海生工公司，可提取性核抗原(extractable nuclear antigens，ENA)自身抗體譜酶免疫斑點(diǎn)法檢測(cè)試劑盒為杭州歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷公司產(chǎn)品，抗-U1RNP標(biāo)準(zhǔn)血清為德國(guó)IMTEC公司產(chǎn)品。電穿孔儀、紫外分光光度計(jì)為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品，PE 2400型PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品，蛋白半干電轉(zhuǎn)移裝置為瑞典Pharmacia公司產(chǎn)品，GSG-2000凝膠圖像分析系統(tǒng)為珠海黑馬醫(yī)療儀器公司產(chǎn)品。培養(yǎng)基LB(10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取粉、10 g/L氯化鈉)，LBA(LB加100μg/ml氨芐青霉素)，復(fù)合培養(yǎng)基YEPD(yeast extract peptone dextrose)含10 g/L酵母提取粉、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖、20 g/L瓊脂，MD(minimal dextrose)含13.4 g/L YNB、0.0004 g/L 生物素、20 g/L 葡萄糖、15 g/L瓊脂，BMGY含10 g/L酵母提取粉、20 g/L蛋白胨、13.4 g/L YNB、1%甘油、100 mmol/L pH 6.0 磷酸鉀緩沖液、0.0004 g/L生物素，誘導(dǎo)分泌表達(dá)培養(yǎng)基BMMY自制，將BMGY中的1%甘油替換為0.5%甲醇。以U1RNP 70K基因兩端序列自行設(shè)計(jì)引物，正向引物5'-CCTACGTAATGACCCAGTTCCTGCCG-3'，劃線部分為SnaBⅠ酶切位點(diǎn)、反向引物:5'-ACGCGGCCGCTCACTCC GGCGCAGCCTC-3'，劃線為 NotⅠ酶切位點(diǎn)，由上海英駿生物技術(shù)公司合成。

1.1.2 血清樣本 患者血清共57份，均經(jīng)ENA自身抗體譜酶免疫斑點(diǎn)試劑盒檢測(cè)抗U1RNP陽(yáng)性。其中MCTD患者15例，男3例，女12例，平均年齡32歲;系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupys erythematosus，SLE)患者30例，男9例，女21例，平均年齡34歲;狼瘡性腎炎患者12例，男5例，女7例，平均年齡14歲。健康體檢者血清50份，男26名，女24名，平均年齡28歲。常規(guī)靜脈采血，分離血清，－20℃保存。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增基因 HL-60細(xì)胞在5%CO2孵箱培養(yǎng)24～48 h，至細(xì)胞數(shù)量達(dá)106/ml收獲，最大細(xì)胞數(shù)＜1×107，4000 r/min離心10 min，離心半徑5 cm。棄上清液。按試劑盒說(shuō)明提取總RNA，用重組小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MuLV RT)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈。以HL-60 cDNA為模板擴(kuò)增U1RNP 70K，PCR 反應(yīng)體系條件:98℃ 10 s、56℃ 5 s、72℃90 s，30個(gè)循環(huán)。取10μl 1.0%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。

1.2.2 PCR產(chǎn)物的TA克隆、鑒定及測(cè)序 按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行將膠回收后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，重組克隆質(zhì)粒用Sna BⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定，由上海生工公司測(cè)序。

1.2.3 pPIC9k-U1RNP 70K的構(gòu)建 抽取經(jīng)酶切鑒定，測(cè)序正確的TA克隆質(zhì)粒和酵母分泌型表達(dá)質(zhì)粒pPIC9k用Sna BⅠ和NotⅠ雙酶切后，電泳回收所需片段，定向連接，用CaCl2法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主菌E.coli JM109。挑取轉(zhuǎn)化子，雙酶切鑒定并測(cè)序。

1.2.4 pPIC9k-U1RNP 70K在畢赤酵母中的轉(zhuǎn)化用SalⅠ線性化pPIC9k-U1RNP 70K，以線性化DNA電穿孔法(1300 V，25μF，200Ω)轉(zhuǎn)化組氨酸合成缺陷型宿主酵母SMD1168，經(jīng)組氨酸缺乏的MD平板篩選重組轉(zhuǎn)化子，未重組的組氨酸缺陷型酵母宿主細(xì)胞在MD平板上不生長(zhǎng)。用含不同濃度G418的YEPD平板從轉(zhuǎn)化子中篩選G418高抗性的高拷貝轉(zhuǎn)化子。

1.2.5 高拷貝轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定 按3 S柱離心式酵母基因組制備試劑盒操作說(shuō)明提取高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子DNA，用PCR試劑盒擴(kuò)增鑒定。

1.2.6 U1RNP 70K的誘導(dǎo)表達(dá) 將2株高拷貝轉(zhuǎn)化子分別接種于100 m l BMGY增菌培養(yǎng)基中，30℃振蕩過(guò)夜至吸光度(A)值600為3～6。菌液于離心半徑5 cm，5000 r/min離心5min，棄上清液。沉淀重懸于25 ml BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。30℃振蕩培養(yǎng)，持續(xù)3 d，每天補(bǔ)加體積百分?jǐn)?shù)為0.5%的甲醇，離心后棄沉淀，上清液經(jīng)80%硫酸銨沉淀后復(fù)溶，置－20℃保存。無(wú)外源基因的空白載體pPIC9k轉(zhuǎn)入宿主菌作為陰性對(duì)照，于同樣條件下誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.7 SDS-PAGE 取 －20℃保存的表達(dá)產(chǎn)物20 μl與2×上樣緩沖液等體積混和后上樣，電泳后用考馬斯亮藍(lán)R250染色。

1.2.8 Western blot鑒定 用半干電轉(zhuǎn)移儀將SDSPAGE凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉，一抗為抗U1RNP標(biāo)準(zhǔn)血清，二抗為鼠抗人的標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶的鼠抗人抗體，用DAB、H2O2顯色。

1.2.9 表達(dá)產(chǎn)物的純化 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)80%硫酸銨沉淀后復(fù)溶，用Sephacryl-100凝膠層析柱過(guò)濾純化，收集并鑒定目的蛋白峰。

1.2.10 建立檢測(cè) U1RNP 抗體的 DIGFA［5］及方法學(xué)評(píng)價(jià) 將初步純化的畢赤酵母重組人自身抗原U1RNP 70K，用 pH 7.4 PBS緩沖液溶解至濃度約0.5 g/L，取1μl點(diǎn)加在硝酸纖維素膜上，37℃烘干，用10 g/L BSA封閉，烘干后，裝于自制的滲濾盒中。在反應(yīng)孔內(nèi)加100μl待檢血清，待其完全滲入，滴加A試劑(金標(biāo) SPA)3滴，待滲入，再滴加 B試劑(0.01 mol/L，pH 7.4 PBS)2 滴，待滲入后觀察結(jié)果。在反應(yīng)孔內(nèi)出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)者為抗U1RNP 70K抗體陽(yáng)性，不出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)為陰性。陽(yáng)性強(qiáng)度按紅色斑點(diǎn)的深淺度不同以+～++++表示。如需檢測(cè)抗體滴度，將血清用等滲鹽水倍比稀釋后再行檢測(cè)。各類血清標(biāo)本對(duì)用所建立的DIGFA與歐蒙酶免疫斑點(diǎn)法進(jìn)行對(duì)比分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SAS 8.1軟件進(jìn)行，各組計(jì)數(shù)資料率的比較采用校正配對(duì)χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 U1RNP 70K基因的擴(kuò)增 PCR產(chǎn)物電泳顯示1條約1300 bp的擴(kuò)增條帶，符合1314 bp的U1RNP 70K基因序列長(zhǎng)度，見(jiàn)圖1。

圖1 U1RNP 70K基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Figure 1 Agarose gel electrophoresis of the PCR product of U1RNP 70K

2.2 pMD18-TA克隆及pPIC9k-U1RNP 70K重組子的雙酶切鑒定 經(jīng)Sna BⅠ和NotⅠ雙酶切后，得到長(zhǎng)為9276和1314 bp的2條片段，分別為pPIC9k和U1RNP 70K，符合預(yù)期結(jié)果，見(jiàn)圖2。

圖2 重組質(zhì)粒酶切電泳圖Figure 2 Restrictive digestion analysis of pPIC9K-U1RNP 70K recombinant plasm ids

2.3 pMD18-TA克隆及pPIC9k-U1RNP 70K重組子的序列測(cè)定 測(cè)序圖譜與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)公布的人U1RNP 70K基因序列(編號(hào):NM-003089)完全一致。部分測(cè)序圖譜見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 pMD18-TA-U1RNP 70K重組質(zhì)粒5'端測(cè)序圖Figure 3 5'sequencing of the recom blnant vector

圖4 pPIC9K-U1RNP 70K重組質(zhì)粒5'端測(cè)序圖Figure 4 5'sequencing of the pPIC9K-U1RNP 70K recomblnant vector

2.4 高拷貝U1RNP 70K酵母重組菌的PCR鑒定酵母重組菌DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，呈現(xiàn)一條特異性擴(kuò)增區(qū)帶，與預(yù)期片段長(zhǎng)度(1314 bp)一致。見(jiàn)圖5。

圖5 高拷貝U1RNP 70K酵母重組菌PCR電泳圖Figure 5 Agarose gel electrophoresis for PCR analysis of high copies recombinant transformants

2.5 SDS-PAGE和Western bolt分析 結(jié)果顯示高拷貝陽(yáng)性表達(dá)菌表達(dá)了1條相對(duì)分子質(zhì)量約70 000的特異性蛋白條帶，僅能被抗U1RNP標(biāo)準(zhǔn)血清識(shí)別，見(jiàn)圖6。

圖6 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western blot結(jié)果Figure 6 SDS-PAGE and Western blot of the recombinant protein

2.6 DIGFA 檢測(cè) 與BSA陰性對(duì)照比較，初步純化的高拷貝陽(yáng)性菌表達(dá)產(chǎn)物的2個(gè)斑點(diǎn)均顯紅色結(jié)果，證明表達(dá)產(chǎn)物具有天然U1RNP 70 K蛋白的免疫原性，能被抗U1RNP陽(yáng)性的患者血清識(shí)別，見(jiàn)圖7。

圖7 表達(dá)產(chǎn)物的DIGFA分析Figure 7 DIGFA analysis of the expression product

2.7 與歐蒙斑點(diǎn)法檢測(cè)結(jié)果的比較 用所建立的DIGFA法檢測(cè)歐蒙ENA酶斑點(diǎn)法抗U1RNP抗體陽(yáng)性的患者血清57份，其中包括臨床確診的MCTD患者15例，SLE患者30例，狼瘡性腎炎患者12例，同時(shí)檢測(cè)50份健康體檢者血清標(biāo)本。檢測(cè)結(jié)果顯示，有3例SLE患者為陰性。健康體檢者中有1例為陽(yáng)性，可能是由于酵母重組U1RNP 70K蛋白純化不徹底，而該受檢者體內(nèi)存在抗酵母抗體所致。以歐蒙ENA酶斑點(diǎn)法為標(biāo)準(zhǔn)，DIGFA的陽(yáng)性符合率為94.74%(54/57)，陰性符合率為98.00%(49/50)，總符合率為96.26%(103/107)。采用 SAS 8.1軟件進(jìn)行校正配對(duì)χ2檢驗(yàn)，顯示2種方法檢測(cè)結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著性差異，χ2=0.250，P=0.617。見(jiàn)表1。

表1 2種方法檢測(cè)抗U1RNP 70K抗體結(jié)果比較(n)Table 1 Comparison of two methods in detecting anti-U1RNP 70K antibodies(n)

3 討 論

U1RNP 70K屬于小核糖核蛋白家族，由437個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。該蛋白的實(shí)際分子質(zhì)量約為52000，但由于其C末端尾部含有帶高電荷的由精氨酸-谷氨酸/天冬氨酸和精氨酸-絲氨酸組成的重復(fù)序列結(jié)構(gòu)，在SDS-PAGE中的遷移速度接近于70000，故稱之為 U1RNP 70K［6］。U1RNP 抗原由U1RNA和11種蛋白組成，其中8種是所有snRNP共有的蛋白(B'、B、D1、D2、D3、E、F 和 G)，而其他 3種U1RNP-70K、U1RNP-A、U1RNP-C為U1RNP的特異性蛋白。U1RNP為復(fù)合自身抗原，除MCTD外，SLE、系統(tǒng)性硬化癥等多種自身免疫病患者血清均可檢出抗U1RNP抗體。在SLE患者中陽(yáng)性率可達(dá)30%～40%，伴 Sm抗體出現(xiàn)或單獨(dú)出現(xiàn)［7］。在U1RNP抗原中 U1RNP-70K、U1RNP-A、U1RNP-C能與抗U1RNP抗體發(fā)生反應(yīng)，其中U1RNP 70K抗原是U1RNP抗原復(fù)合物中的特異性蛋白之一，其抗體可代替抗U1RNP抗體用于 MCTD的輔助診斷［8］。Combe 等［9］用 Western blot證實(shí) U1RNP 70K 是MCTD的主要標(biāo)志性自身抗原，可與抗U1RNP抗體特異性結(jié)合。

在外源基因的人工重組表達(dá)過(guò)程中，考慮到蛋白翻譯后修飾加工等因素，人源真核基因在真核系統(tǒng)表達(dá)較原核系統(tǒng)更為適宜［10－13］。巴斯德畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)產(chǎn)物在糖基化、磷酸化、二硫鍵空間折疊等方面已接近天然蛋白水平，尤其免疫原性明顯增強(qiáng)，適合于表達(dá)蛋白疫苗及診斷用重組抗原［14－15］。本研究用酵母菌成功地表達(dá)人源U1RNP 70K蛋白，經(jīng)初步純化后，建立了檢測(cè)抗U1RNP 70K抗體的斑點(diǎn)免疫金滲慮檢測(cè)法，操作簡(jiǎn)便快速且結(jié)果準(zhǔn)確，可用于臨床常規(guī)檢測(cè)。

［1］Alarcon-Segovia D，Cardiel MH.Comparison between 3 diagnostic criteria for mixed connective tissue disease.Study of 593 patients［J］.J Rheum，1989，16(3):328-334.

［2］Hof D，Cheung K，de Rooij DJ，et al.Autoantibodies specific for apoptotic U1-70K are superior serological markers for mixed connective tissue disease［J］.Arthritis Res Ther，2005，7(2):R302-R309.

［3］沈 南，薛 峰，陸 瑜，等.自身核抗原U1RNP 70kD多肽全長(zhǎng)基因克隆及鑒定［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，1997，13(1):15-18.

［4］薛 峰，沈 南，陸 瑜，等.重組自身抗原U1RNP多肽的制備及在風(fēng)濕病診斷中的意義［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，1997，77(5):340-343.

［5］蘭小鵬，黃俏佳，葉小芬，等.用快速斑點(diǎn)免疫金滲濾法檢測(cè)抗雙鏈 DNA 抗體［J］.中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，1996，19(2):92-94.

［6］Nagai K，Muto Y，Pomeranz Krummel DA.Structure and assembly of the spliceosomal snRNPs［J］.Biochem Soc Trans，2001，29(2):15-26.

［7］Netter HS，Guldner HH，Szostecki C，et al.Major autoantigenic sites of the(Ul)small nuclear ribonucleoprotein-specific 68-kDa protein［J］.Scand J Immunol，1990，32(2):163-176.

［8］Salmhofer W，Hermann J，Joch M，et al.High serum levels of antibodies against the recombinant 70 kDa ribonucleoprotein are useful for diagnosing mixed connective tissue disease［J］.Eur Acad Dermatol Venereol，2007，21(8):1047-1053.

［9］Combe B，Rucheton M，Graafiand H，et al.Clinical significance of anti-RNP and anti-Sm autoantibodies as determined by immunoblotting and immunoprecipitation in sara from patients with connective tissue diseases［J］.Clin Exp Immunol，1989，75(1):18-24.

［10］張春華，李芳秋，繆家文.人穿孔素真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2008，21(2):115-117.

［11］陳麗華，張新海，謝 鑫，等.人 pSecTag2B-CD226真核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及初步鑒定［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2008，21(3):227-230.

［12］鄧興力，楊智勇，董 堅(jiān)，等.人神經(jīng)生長(zhǎng)因子β基因克隆及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2009，22(1):108-110.

［13］程忠良，秦 瑾，劉正湘，等.ICAP1α基因及其突變體T38A、I138A真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2009，22(12):1243-1247.

［14］章如安，楊 晟，邱榮德，等.巴斯德畢赤酵母表達(dá)體系研究及進(jìn)展［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2000，27(5):371-373.

［15］楊湘越，蘭小鵬，顏宏利，等.畢赤酵母重組豬囊尾蚴抗原cC1的特征研究［J］.中國(guó)人獸共患病雜志，2004，20(3):241-243.