平海林，吳金英，徐勝威，胡開順，段志剛

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院水生經(jīng)濟(jì)動物研究所∥廣東省水生經(jīng)濟(jì)動物良種繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510275)

轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)主要由巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血小板產(chǎn)生[1]，能參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，例如細(xì)胞增殖、分化、存活、遷移以及免疫細(xì)胞的活化和失活等[2]。進(jìn)化研究表明，TGF-β基因相當(dāng)保守，其配體、受體和與家族蛋白有關(guān)的信號分子在節(jié)肢動物中也存在，表明該基因在10億年前就已存在[3]。哺乳動物中發(fā)現(xiàn)TGF-β有3種異構(gòu)體：TGF-β1、2、3，其中TGF-β1在所有免疫細(xì)胞中都有所表達(dá)，并在出現(xiàn)各種壓力和多種疾病信號后，參與細(xì)胞反應(yīng)[4]。如阻斷免疫細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)，會導(dǎo)致疾病，并伴隨慢性炎癥的纖維化過程[5]，寄生蟲病中，TGF-β1分泌可以阻斷巨噬細(xì)胞活化，并削弱它們的氧化反應(yīng)[6]，人類腹腔和腸道炎癥疾病中，TGF-β1信號減少[7]。在免疫系統(tǒng)中，成熟的TGF-β1多肽是一種強(qiáng)有力的細(xì)胞分化調(diào)節(jié)劑和免疫抑制劑，并能下調(diào)許多細(xì)胞因子的表達(dá)。例如，TGF-β1通過Smad3信號通路抑制巨噬細(xì)胞生長[8]，通過誘導(dǎo)TGF-β靶基因Id3抑制B細(xì)胞的增殖[9]，也可以誘導(dǎo)結(jié)締組織生長因子(CTGF)，促使傷口上的成纖維細(xì)胞增殖[10]。

在魚類研究中，TGF-β1序列已經(jīng)從虹鱒、斑馬魚、鯉魚、草魚、金魚、真鯛和海鱸中克隆得到[11-17]，其功能研究報道主要如下：哺乳類重組TGF-β1可以抑制虹鱒巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)活動和頭腎白細(xì)胞產(chǎn)生巨噬細(xì)胞活化因子[18-19]；可以誘導(dǎo)草魚外周血液淋巴細(xì)胞的增殖，也可以阻斷由植物血凝素或者脂多糖刺激引起的草魚外周血液淋巴細(xì)胞的增殖[14]；可以抑制斑馬魚卵細(xì)胞成熟，其作用的多位點(diǎn)包括LHR, 20β HSD 和mPR-β[12,20]。重組金魚TGF-β1蛋白能夠誘導(dǎo)金魚成纖維細(xì)胞(CCL71)的增殖，對TNF-α活化巨噬細(xì)胞的硝化氧化反應(yīng)有下調(diào)作用[15]。在大西洋鮭中，TGF-β1下調(diào)可導(dǎo)致上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞敏化性增強(qiáng)，不能維持正常的遠(yuǎn)端腸道黏膜的完整性[21]。

本研究通過中間片段克隆并結(jié)合RACE技術(shù)，克隆得到了斜帶石斑魚EpinepheluscoioidesTGF-β1 cDNA全長序列，并通過Realtime PCR技術(shù)檢測了該基因在健康斜帶石斑魚不同組織的分布情況，還檢測了用PolyI:C或ConA刺激斜帶石斑魚頭腎淋巴細(xì)胞不同時間后，TGF-β1基因的表達(dá)情況。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚和樣品的采集

實(shí)驗(yàn)用健康斜帶石斑魚，2齡，長25～30 cm，體質(zhì)量約700 g，購自大亞灣水產(chǎn)實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)前至少暫養(yǎng)1周。取樣時先用 MS-222(Sigma，美國)麻醉實(shí)驗(yàn)魚并抽出血液，再取所需各組織樣品，用液氮速凍保存，然后放于 -80 ℃冰箱備用。

1.2 TGF-β1 cDNA的克隆和測序

用常規(guī)Trizol(Invitrogen，美國)抽提法從斜帶石斑魚腎臟中提取總RNA，將總RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO，日本)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，并以此作為模板利用簡并引物(表1)擴(kuò)增TGF-β1中間片段，然后利用特異性引物(表1)結(jié)合RACE技術(shù)得到全長TGF-β1 cDNA序列。PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T 載體中(TaKaRa，日本)，序列測序由華大基因公司完成。

1.3 生物信息學(xué)分析

用BLAST程序搜索基因庫分析TGF-β1分子的同源性，通過DNAtools 6.0分析開放讀碼框和相應(yīng)的氨基酸序列。多重比對通過CLUSTAL W(www.ebi.ac.uk/clustalw)來實(shí)現(xiàn)。通過Mega 3.1軟件的N-J方法來構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.4 Realtime PCR分析

Realtime PCR分析所用儀器為ABI的PRISM-7900。每個實(shí)驗(yàn)樣品設(shè)3個重復(fù)，根據(jù)TGF-β1基因序列合成定量用特異性引物(表 1)，以斜帶石斑魚的β-肌動蛋白cDNA作為內(nèi)參，分析TGF-β1 mRNA的表達(dá)譜。

1.5 細(xì)胞孵育和免疫刺激

實(shí)驗(yàn)魚先用MS-222麻醉并抽出血液，斷頭后取出頭腎，用RPMI-1640培養(yǎng)基(Invitrogen，美國)洗除表面血液，并將組織塊在冰上剪碎，研磨成單細(xì)胞，過300目篩得到單細(xì)胞懸浮液。4 ℃，2 000 r/min 離心10 min，用RPMI-1640 培養(yǎng)基洗滌沉淀兩次，去上清，加入4 mL組織培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液小心地鋪在3 mL淋巴細(xì)胞分離液(GE Healthcare，瑞士)中，19 ℃，1 500 r/min 離心50 min，收集淋巴細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，在27 ℃，φ=5% CO2的條件下培養(yǎng)5 h之后除去粘附細(xì)胞，收集懸浮細(xì)胞，重新培養(yǎng)在六孔板中，再向培養(yǎng)基中加入50 μg/mL的 PolyI:C(Amersham Bio-science，美國)或10 μg/mL 的ConA(Sigma，美國)，以沒加刺激物的細(xì)胞做陰性對照，設(shè)2、4、8、16和24 h 5個時間段，每個條件組設(shè)3個重復(fù)。通過離心收集細(xì)胞，加入1 mL Trizol用于總RNA的提取，最后用Realtime PCR分析TGF-β1的表達(dá)情況。

表1 引物序列和用途

1.6 統(tǒng)計分析

統(tǒng)計數(shù)值采用算術(shù)平均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差來表示(n=3)。統(tǒng)計差異性用單因子方差分析中的LSD和Duncan’s檢測，0.05和0.01水平用來指示差異的顯著性，所有數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 16.0軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1 斜帶石斑魚TGF-β1 cDNA全長序列

利用中間片段非特異性擴(kuò)增并結(jié)合RACE技術(shù)，克隆得到了斜帶石斑魚TGF-β1 cDNA全長序列(GenBank 登錄號為GQ503351)，全長為2 477 bp，5′非編碼區(qū)為47 bp，3′非編碼區(qū)為1 269 bp，開放讀碼框(Open Reading From, ORF)為1 161 bp，編碼一種含386個氨基酸的多肽，包括含信號肽的前導(dǎo)肽和含112個氨基酸的成熟肽。在3′非編碼區(qū)polyA前共有5個在細(xì)胞因子上常見的mRNA不穩(wěn)定點(diǎn)(ATTTA)和一個多聚腺苷酸加尾信號(AATAAA)。

2.2 斜帶石斑魚TGF-β1的同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析

選取的其它物種及其基因在GenBank的氨基酸序列號列舉如下：斜帶石斑魚Epinepheluscoioides，ACV96791；海鱸Moronechrysops×Moronesaxatilis，AAD46997；真鯛Sparusaurata，AAN03842；虹鱒Oncorhynchusmykiss，CAA67685；斑馬魚Daniorerio，AAI62361；大西洋鮭Salmosalar，ACN11294；草魚Ctenopharyngodonidella，ABU84814；鯉魚Cyprinuscarpio，AAF22573；金魚Carassiusauratus，ABU55371；蠑螈Ambystomamexicanum，ABX24523；牛Bostaurus，AAA30778；馬Equuscaballus，AAD49431；豬Susscrofa，AAC83807；挪威鼠Rattusnorvegicus，AAH76380；家鼠Musmusculus，AAH13738；長尾猴Chlorocebusaethiops，AAA35369；人Homosapiens，AAH01180。

氨基酸序列比對結(jié)果顯示，在前導(dǎo)肽區(qū)域有整合素結(jié)合位點(diǎn)(RGD)和KEX-Furin樣蛋白酶識別位點(diǎn)(RKKR)；成熟肽區(qū)域有36位點(diǎn)的脯氨酸和46位點(diǎn)的甘氨酸以及由9個半胱氨酸組成的典型的“cysteine knot”結(jié)構(gòu)(圖 1)。用MEGA3.1鄰接法構(gòu)建TGF-β1家族進(jìn)化樹結(jié)果表明，斜帶石斑魚和其他魚類進(jìn)化樹在同一分支上，與海鱸親緣關(guān)系最近，與兩棲類和哺乳類親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖 2)。

圖1 斜帶石斑魚TGF-β1的氨基酸序列與已知的其它魚類序列的比較

2.3 斜帶石斑魚TGF-β1的組織表達(dá)分析

Realtime PCR 結(jié)果表明，斜帶石斑魚TGF-β1基因在腎臟、頭腎、脾臟、鰓、肝臟、腸道、心臟、肌肉、腦、性腺、眼各組織中均有表達(dá)，其中在腎臟中表達(dá)最高，其次是頭腎和脾臟，在肌肉和眼中表達(dá)最少(圖 3)。

圖2 斜帶石斑魚和其它動物TGF-β1氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化數(shù)構(gòu)建

圖3 TGF-β1在健康斜帶石斑魚各組織中的表達(dá)分析

2.4 斜帶石斑魚TGF-β1在刺激頭腎淋巴細(xì)胞中的表達(dá)分析

Realtime PCR 結(jié)果表明，用PolyI:C或ConA刺激頭腎淋巴細(xì)胞后，斜帶石斑魚TGF-β1表達(dá)量都明顯上升，刺激4 h后達(dá)到最高，其中ConA組是對照組表達(dá)量的27倍，PolyI:C組是對照組的3倍。刺激4 h后表達(dá)量均有所下降，其中用PolyI:C刺激頭腎淋巴細(xì)胞16、24 h后，TGF-β1基本無表達(dá)，而用ConA刺激實(shí)驗(yàn)組，雖然在4 h后TGF-β1表達(dá)量有所下降，但一直高于對照組(P<0.05)，特別在刺激4、8、16 h后，表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.01)(圖 4)。

圖4 斜帶石斑魚TGF-β1在刺激頭腎淋巴細(xì)胞中的表達(dá)

3 討 論

本研究克隆得到了斜帶石斑魚TGF-β1全長cDNA序列，在成熟肽區(qū)域，具有和其他魚類一樣保守的9個半胱氨酸組成的典型的“cysteine knot”結(jié)構(gòu)[12,15,17,22]，其中的8個半胱氨酸以成對的方式形成分子中心區(qū)的4對鏈內(nèi)二硫鍵，結(jié)合第9個半胱氨酸形成鏈間二硫鍵一起形成TGF-β二聚體[11]。整合素結(jié)合位點(diǎn)(RGD)能夠與整合素特異結(jié)合，例如能夠與αvβ6特異結(jié)合，從而使?jié)摶钚偷腡GF-β1活化[23]，KEX-Furin樣蛋白酶識別位點(diǎn)(RKKR)可以使前體蛋白轉(zhuǎn)化為成熟蛋白，另有研究顯示C型膠原蛋白酶也可通過此位點(diǎn)裂解TGF-β前期復(fù)合物[11]，以及成熟肽36位點(diǎn)的脯氨酸和46位點(diǎn)的甘氨酸，都表明斜帶石斑魚TGF-β1具有超家族特征標(biāo)志[22]，延續(xù)了TGF-β1基因在進(jìn)化過程中的保守性。

TGF-β1基因在所取斜帶石斑魚的各個組織中都表達(dá)，而在虹鱒和草魚中，TGF-β1基因在肝臟中檢測不到表達(dá)[11,14]，在鯉魚肌肉中檢測不到表達(dá)[13]，表明TGF-β1在魚類各組織中的表達(dá)具有一定差異性。在硬骨魚類，像草魚和斑馬魚，腎臟是主要的B細(xì)胞產(chǎn)生和結(jié)合位點(diǎn)[24]；虹鱒中，發(fā)育中的B細(xì)胞在頭腎中成熟，然后遷移到脾臟或者后腎的活化位點(diǎn)[25]；脾臟是免疫球蛋白M在軟骨魚類表達(dá)的第一個站點(diǎn)[26]，斜帶石斑魚TGF-β1基因在腎臟、頭腎、脾臟中高表達(dá)，表明TGF-β1基因在斜帶石斑魚免疫系統(tǒng)中可能具有潛在功能。

用PolyI:C和ConA刺激斜帶石斑魚頭腎淋巴細(xì)胞后，TGF-β1基因表達(dá)量升高，這與在鯉魚頭腎白細(xì)胞中觀察到的結(jié)果一致[13]。另有報道表明，在金魚和虹鱒中，用LPS和rTNF-α刺激的巨噬細(xì)胞中，TGF-β1基因表達(dá)量也上升[15,27]。因此，斜帶石斑魚TGF-β1的表達(dá)量在刺激后有所上升，表明了TGF-β1對類似有絲分裂類因子的刺激，與其它典型的細(xì)胞因子一樣做出了積極反應(yīng)，對淋巴細(xì)胞的活化是必不可少的[28]。在刺激超過4 h后，可能是前4 h大幅增加的TGF-β1抑制了淋巴細(xì)胞的增殖，從而使TGF-β1表達(dá)量下降，有研究報告表明，LPS和ConA可誘導(dǎo)鯉魚外周血液淋巴細(xì)胞的增殖[29]，而rTGF-β1可以阻斷由PHA和LPS誘導(dǎo)的草魚外周血液淋巴細(xì)胞的增殖[14]，表明TGF-β1在調(diào)控魚類淋巴細(xì)胞的增殖方面和哺乳類具有相似的作用，但其作用的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

TGF-β1作為一種多效應(yīng)的細(xì)胞免疫因子，其功能在哺乳動物中研究較多，作用的效果取決于多項(xiàng)因素，如分泌的時間，濃度，受體的表達(dá)，細(xì)胞分化的周期等[30-32]，但是在魚類，對TGF-β1的功能研究還比較少，有待進(jìn)一步發(fā)展和完善。

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