■文/王 偉

液相色譜是原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測重要的初篩手段，實際工作中如果檢測出來樣品中含有高于檢出限濃度的三聚氰胺，要用氣質(zhì)和液質(zhì)進(jìn)行確認(rèn)，因為液相法有很多時候檢出是假陽性。但作為基層檢測機(jī)構(gòu)，液相色譜仍然是經(jīng)濟(jì)、實用的方法。GB/T22388-2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》規(guī)定高效液相色譜法檢測原料乳與乳制品中三聚氰胺為第一法。筆者就本實驗室的條件對該方法進(jìn)行了驗證實驗，并總結(jié)了檢測中的操作技術(shù)要點。

方法原理

1.原理:試樣用三氯乙酸溶液-乙腈提取，經(jīng)陽離子交換固相萃取柱凈化后，用高效液相色譜法測定，外標(biāo)法定量。

2.試劑與材料:甲醇、乙腈、氨水、三氯乙酸、檸檬酸、庚烷磺酸鈉、三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品、陽離子交換固相萃取柱、定性濾紙、海砂、微孔濾膜、氮氣均按GB/T22388-2008規(guī)定。

3.儀器和設(shè)備:P200Ⅱ型高效液相色譜儀-紫外檢測器。離心機(jī)、超聲波水浴、固相萃取裝置、氮氣吹干儀、具塞塑料離心管。

4.樣品處理:樣品用三氯乙酸溶液提取、用陽離子交換固相萃取柱凈化、吹氮氣保護(hù)濃縮、定容。

5.高效液相色譜測定:色譜參考條件:島津C8柱250n m，用離子對試劑:乙腈(95:5)的流動相條件，島津C18柱250n m，用離子對試劑:乙腈(90:10)的流動相條件。波長:240nm。柱溫:40℃。

技術(shù)要點

1.樣品提取

1)樣品溶解:實驗中，固體樣品如奶粉加三氯乙酸溶液直接超聲，超聲后奶粉有時并不能溶解。效果比較好的做法是稱取奶粉樣品2.0g置于50mL的離心管中，試劑分次加，先加10毫升的三氯乙酸溶液，震蕩幾下，使之溶解，后用5毫升三氯乙酸溶液和5毫升乙腈沖干凈離心管壁，然后搖晃幾下，混勻后待超聲。

2)超聲、振蕩、離心:為了提取的徹底，我們參考N Y/T1372-2007標(biāo)準(zhǔn)，超聲時間20分鐘，然后振蕩，這個步驟很重要，通過比較，僅超聲不振蕩提取效果差一些。水浴搖床對50毫升的離心管來說效果不太好，直接加蓋后用手動振搖，注意時間要保證10分鐘，效果比較好；或者把試樣稱取在25ml的容量瓶中提取，在水浴搖床上振搖10分鐘，同時給予40℃的保溫加熱，提取效果也很好。

實驗證明離心轉(zhuǎn)速越大離心的效果越好，我們使用9000～10000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速，離心5分鐘。不同品種的樣品，有些樣品會存在離心后有脂肪組織漂在上面的現(xiàn)象。如果沒有脂肪，可以把上清液不過濾直接定容至25毫升；如果有脂肪可采用先過濾后定容的方式比較好。

2.凈化過柱。一是每一批小柱都要先測試一次小柱的加標(biāo)回收率，以確定小柱的性能是否達(dá)到使用要求。二是小柱在使用之前必須要活化，否則吸附不了要分析的物質(zhì)。三是整個凈化過程中不能讓小柱干了，注意液體在接近干的時候就要加入下一種液體，小柱干了，柱床會產(chǎn)生裂縫，直接影響到加標(biāo)回收率。四是凈化過程要控制過柱的流速，因為流速過快導(dǎo)致該吸附的物質(zhì)沒有吸附完全而影響到加標(biāo)回收率。最后當(dāng)洗脫液濾干的時候，可以用負(fù)壓抽一下，把小柱里沒法通過重力流下來的洗脫液抽下來，確保收集完全。

3.上機(jī)測定。洗脫液用氮氣吹干，殘留物用1ml的流動相定容，供高效液相色譜儀測定。用流動相將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品配置為標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的濃度系列，上機(jī)測得峰面積，以峰面積-濃度作圖，得到回歸方。同時測定待測樣品。使用的液相色譜儀和色譜柱不同，出峰時間和分離效果也不相同。通常我們使用日本島津公司的液相色譜儀，用島津C8柱用離子對試劑:乙腈(95:5)的流動相條件，島津C18柱用離子對試劑:乙腈(90:10)的流動相條件。在遇到干擾峰和三聚氰胺峰分不開、干擾峰和三聚氰胺峰重疊，或干擾峰的保留時間和標(biāo)樣保留時間基本一致，可以考慮適當(dāng)調(diào)整流動相配比以達(dá)到干擾峰與三聚氰胺峰分離開的效果。按照上面的處理步驟，加標(biāo)回收率在85%～106%左右，符合實驗要求。