陳苗苗，林良才，馬昱澍，王風清，魏東芝

(華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室 魯華生物技術研究所，上海 200237)

甾體激素在臨床上應用廣泛，是僅次于抗生素的第二大類藥物。目前甾體藥物的合成主要依賴于半合成，常用方法是利用微生物轉化和化學修飾相結合的方式對天然甾體化合物進行結構改造[1]。其中，C1，2位脫氫反應是甾體微生物轉化中最重要的反應類型[2]。許多具有抗炎活性的甾體藥物在C1，2位導入雙鍵后，能成倍地增加抗炎活性[3]。3-酮基-4-烯-甾體的C1，2位脫氫反應一般由3-甾酮-Δ1-脫氫酶(KstD)負責[4]。目前，放線菌屬的多種細菌被證實存在KstD活性，如簡單節(jié)桿菌[5]、紅球菌[6]、分枝桿菌[7]、諾卡氏菌[8]等。為了提高野生菌活性，研究者嘗試對KstD進行異源表達。大腸桿菌是最成功和最有效的異源表達宿主之一[9，10]，該系統(tǒng)具有成本低廉、生產(chǎn)效率高和操作簡單等優(yōu)點，但是將簡單節(jié)桿菌(Arthrobactersimplex)KstD在大腸桿菌中表達時，活性卻幾乎為零[11]；同時，將紅串紅球菌(Rhodococcuserythropolis)KstD在大腸桿菌中進行異源表達，所得KstD蛋白中40%～50%為包涵體，且重組菌不具有C1，2位脫氫活性[12]。此外，由于大腸桿菌沒有甾體泵入泵出機制，只能靠發(fā)酵液中分子的自然擴散，而甾體是幾乎不溶于水的，因此，雖然對于各種KstD在大腸桿菌系統(tǒng)中異源表達的研究較多，但其甾體轉化效果并不十分理想。

煙曲霉酸是煙曲霉(Aspergillusfumigatus)的次生代謝產(chǎn)物，其C1，2位有雙鍵結構[13]，據(jù)推測煙曲霉煙曲霉酸合成基因簇中含有負責3-甾酮-Δ1-脫氫反應[13，14]的基因。煙曲霉煙曲霉酸合成基因簇已經(jīng)被全基因測序(Genbank )，根據(jù)已經(jīng)報道的kstD序列與基因簇序列同源比對分析，得到唯一一個具有同源性的編碼基因，命名為kstDF。推測煙曲霉素1，2位的雙鍵就是此基因脫氫形成的。煙曲霉能高效產(chǎn)生煙曲霉酸，預示著KstDF應該有較強的C1，2位脫氫能力，如果在異源表達過程中能表現(xiàn)出良好的活性，該酶就很適合用來開發(fā)高活性的甾體C1，2位脫氫反應的基因工程菌。加之kstDF來源新穎，從序列上分析，該基因與細菌源kstD核苷酸相似性較低，也具有很高的研究價值。

作者首次克隆了煙曲霉煙曲霉酸合成基因簇中的kstDF，并驗證了該真菌基因在大腸桿菌系統(tǒng)中的表達效果，研究了不同誘導條件下KstDF的蛋白表達和活性，進而確定KstDF表達最有利的實驗條件，最后考察了該重組菌轉化甾體藥物的最大能力。

1 實驗

1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

煙曲霉(A.fumigatus) 菌株CICC 40167，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)。大腸桿菌DH5α、BL21(λDE3)及質(zhì)粒pET28a(+)，Novagen公司。

大腸桿菌LB培養(yǎng)基：Tryptone 10 g，Yeast extract 5 g，NaCl 10 g，加水至1000 mL；若配制固體培養(yǎng)基，再加入15 g瓊脂。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、LATaq酶、T4 DNA連接酶、pMD19-T Simple Vector，TaKaRa公司。Plasmid Miniprep Kit、DNA Gel Extraction Kit、Cycle pure Kit，美科美(北京)生物醫(yī)學科技有限公司。引物均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.3 煙曲霉基因組的提取[15]

將從培養(yǎng)皿上刮取的菌體或抽濾收獲的菌體放入研缽中，加液氮后研磨成粉末。向該粉末中以一定比例(2 mL/0.1 g粉末)加入一定量的DNA抽提液[0.2 mol·L-1Tris-HCl(pH值7.5)，NaCl 0.5 mol·L-1，EDTA 0.01 mol·L-1，SDS 1%]和與抽提液等體積的酚-氯仿-異戊醇混合液(體積比為25∶24∶1)，于渦旋器上劇烈渦旋3～6 min，然后8000 r·min-1、4 ℃離心5 min。將上清液轉移到一新離心管，向該離心管中加入2.5 BV的無水乙醇，-20 ℃放置30 min。取出離心管，10 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，棄上清液，在空氣中放置10 min使乙醇揮發(fā)完全。加入適量的TE溶液[10 mmol·L-1Tris-HCl(pH值7.4)，1 mmol·L-1EDTA(pH值8.0)]溶解沉淀即得到基因組DNA。

1.4 煙曲霉kstDF基因的克隆

運用同源序列比對從煙曲霉酸基因簇中釣取出kstDF序列全長，根據(jù)kstDF基因序列，設計擴增引物kstDF-U：5′-CCGAGAATTCATGGCCGCAAGACAGCTC-3′(下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點)和kstDF-D：5′-ATGCAAGCTTCTATACATGCTCAGAAGCAATAT-3′(下劃線部分為HindⅢ酶切位點)。

以煙曲霉基因組DNA為模板，用上述引物擴增kstDF基因。PCR反應體系：2×PCR Mix 25.0 μL，5′-端引物1.0 μL，3′-端引物1.0 μL，模板DNA 0.2 μL，ddH2O 23.0 μL。PCR反應條件：95 ℃變性4 min；95 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，29個循環(huán)；72 ℃保溫10 min，4 ℃保溫。

1.5 重組質(zhì)粒的構建

PCR產(chǎn)物和提取的質(zhì)粒pET28a(+)分別用EcoRⅠ和HindⅢ進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，用T4 DNA連接酶于16 ℃過夜連接，重組質(zhì)粒轉化大腸桿菌DH5α，挑取陽性轉化子分別用PCR和雙酶切法進行驗證，并進行測序。再將驗證完全正確的陽性轉化子的質(zhì)粒轉入宿主菌 BL21(λDE3)中，獲得產(chǎn)KstDF的基因工程菌。

1.6 3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因(kstDF)在大腸桿菌中的表達及誘導條件的優(yōu)化

按1%接種量，將上述基因工程菌接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基(含50 μg·mL-1卡那霉素)中，于37 ℃、250 r·min-1振蕩培養(yǎng)，同時以空宿主BL21(λDE3)作對照。待OD600至0.4～0.6，加入終濃度為0.5 mmol·L-1的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，分別于20 ℃、30 ℃、37 ℃的誘導溫度下進行實驗，150 r·min-1培養(yǎng)6 h，誘導外源蛋白的表達。檢測菌液的OD600，7000 r·min-1、4 ℃離心5 min，收集菌體，用0.05 mol·L-1pH值7.5 Tris-HCl緩沖溶液(0.05 mol·L-1Tris，0.04 mol·L-1HCl)重懸，將OD600濃縮至4.0。取100 μL濃縮后的菌液，加入一定量的蛋白上樣緩沖溶液，煮沸5 min，取10 μL進行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)。

1.7 3-甾酮-Δ1-脫氫酶(KstDF)的活性檢測

向10 mL不同誘導溫度下的重組大腸桿菌濃縮液和BL21(λDE3)濃縮液中分別加入終濃度為13.3 mg·L-1的底物雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD，用乙醇溶解)，在30 ℃、200 r·min-1條件下進行反應，12 h后取樣1 mL，加入等體積乙酸乙酯萃取3次，然后12 000 r·min-1離心10 min，將上清轉移至干凈離心管進行薄層色譜分析(TLC)。同時，將20 ℃誘導6 h的菌株加入AD反應2 h后，用乙酸乙酯萃取3次，進行HPLC分析。

1.8 TLC和HPLC分析方法

TLC分析方法：采用硅膠G板薄層層析技術分離底物AD和目標產(chǎn)物雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)，展層劑中石油醚和乙酸乙酯的體積比為3∶2，點樣量為30 μL。點樣結束后，將薄板置于層析缸中，待層析液的前沿遷移至距離硅膠板前沿1 cm時，取出硅膠板。向硅膠板上噴淋15%(體積分數(shù))硫酸，100 ℃烘烤10 min，待板上物質(zhì)顯色完全后進行分析鑒定。

HPLC分析方法：將用于TLC的樣品置于通風櫥中，待乙酸乙酯揮發(fā)干，向離心管中加入等體積色譜級甲醇，振蕩使沉淀溶解，12 000 r·min-1離心10 min，取出上清進行HPLC實驗。色譜條件：Agilent1100型高效液相色譜儀，Agilent XDB-C18(4.6 mm×250 mm)色譜柱，柱溫40 ℃；采用DAD紫外檢測器，檢測波長254 nm；流動相為甲醇∶水=7∶3，流速1 mL·min-1，進樣量10 μL。

1.9 大腸桿菌表達KstDF酶動力學參數(shù)的測定

以HPLC法檢測大腸桿菌以AD為底物表達KstDF的酶動力學參數(shù)，測定過程中，酶的濃度恒定，改變底物的濃度(不存在底物過量的情況)，測得一組反應初速度。檢測菌液OD600，7000 r·min-1、4 ℃離心5 min收集菌體，用Tris-HCl緩沖溶液(pH值7.5)重懸，將OD600濃縮至4.0。超聲處理破碎細胞(功率200 W，每超聲5 s間隔20 s，共超聲10次，全程在冰上操作)，得到細胞破碎液。1 mL反應混合物(5 mL管盛裝)由800 μL大腸桿菌破碎液、150 μmol·L-1吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)以及一定濃度的底物AD組成[每個反應體系對應的AD濃度(μmol·L-1)分別為8、16、32、64、100、128]，在30 ℃、200 r·min-1條件下培養(yǎng)15 min。向每管各加乙酸乙酯萃取3次，12 000 r·min-1離心10 min，取上層溶液，待有機相揮發(fā)后，加1 mL甲醇復溶，12 000 r·min-1離心10 min，取上層溶液進行HPLC檢測。

2 結果與討論

2.1 3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因(kstDF)的克隆

根據(jù)煙曲霉的kstDF(Genbank accession number XM_746255)全長基因序列，擴增目的基因kstDF。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1所示。

M.DNA分子質(zhì)量標準 1.kstDF

由圖1可知，kstDF基因大小約1791 bp，不包含任何內(nèi)含子，編碼596個氨基酸，預測分子量為64.53 kDa，等電點為7.81(http：//www.expasy.org/cgi-bin/protparam)。與已報道的玫瑰色熱微菌(Thermomicrobiumroseum) DSM 5159 3-甾酮-Δ1-脫氫酶的kstD的氨基酸序列一致性為51%。在KstDF氨基酸序列的N端含有保守的FAD結合結構域，即GSG(A/G)(A/G)(A/G)X17E(圖2)。推測煙曲霉KstDF的活性中心是位于296～323位的27個氨基酸：GERSIRARCGVLLCAGGFAHNQGLRER。

M.tubertulosis:結核分枝桿菌KstD R.erythropolis：紅平紅球菌KstD A.simplex：簡單節(jié)桿菌KstD A.fumigatus：煙曲霉KstD；實線方框和虛線方框分別指示FAD結合結構域和酶活性中心

2.2 重組質(zhì)粒的構建與轉化

將來源于煙曲霉的3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因(kstDF)克隆到質(zhì)粒pET28a(+)中，所得重組質(zhì)粒轉化E.coliBL21(λDE3)，隨機選擇可能的陽性重組子進行菌落PCR和雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳分析如圖3所示。

A：M.DNA標準分子質(zhì)量 1.煙曲霉kstDF B：M′.DNA標準分子質(zhì)量 1′.Hind Ⅲ和Eco RⅠ酶切pET28a(+)-kstDF 2′.pET28a(+)-kstDF

由圖3可知，PCR擴增出的條帶大小約為1800 bp，與實際kstDF大小(1791 bp)相符，對重組質(zhì)粒進行雙酶切獲得大小分別為5400 bp[pET28a(+)]和1800 bp(kstDF)的兩條DNA片段，說明重組菌株構建成功，命名為BL21(DE3)-pET28a-kstDF。

2.3 KstDF的表達及誘導條件的優(yōu)化

重組菌在三個不同的溫度下(20 ℃、30 ℃、37 ℃)分別進行誘導實驗，150 r·min-1誘導6 h后，進行SDS-PAGE鑒定，結果如圖4所示。

M.蛋白標準分子質(zhì)量 1.E.coli BL21(λDE3) 2，3.20 ℃誘導 4，5.30 ℃誘導 6，7.37 ℃誘導

由圖4可知，目的蛋白大小約為66 kDa(箭頭指示位置)，與對照相比，BL21-pET28a-kstDF目的蛋白的表達量較高，且不同誘導溫度的蛋白表達差異明顯。20 ℃表達量最低，37 ℃表達量最高，蛋白表達量隨著誘導溫度的升高而增加。

2.4 KstDF重組大腸桿菌對底物AD的全細胞轉化

向不同誘導條件下的大腸桿菌中分別加入終濃度為13.3 mg·L-1的底物AD，30 ℃、200 r·min-1條件下反應12 h，萃取3次，TLC分析C1，2位脫氫產(chǎn)物ADD的生成量，結果如圖5所示。

1.E.coli BL21(λDE3) 2.20 ℃誘導 3.30 ℃誘導 4.37 ℃誘導

由圖5可知，37 ℃誘導的蛋白表達量最高，但是酶活最低，底物AD有很多剩余；而20 ℃誘導的菌體，雖然蛋白表達量較低但酶活最高，將AD全部轉化為ADD。由此推測低溫誘導有利于KstDF的酶活表達；高溫誘導時，在相同時間內(nèi)KstDF表達量比低溫誘導的表達量高很多，可能因為表達速度過快導致大量KstDF非正確折疊，失去生物學活性。

2.5 重組大腸桿菌轉化AD的HPLC分析

將20 ℃誘導6 h的菌株加入AD反應2 h，萃取3次，揮發(fā)干燥，再用甲醇溶解固形物，用C18色譜柱分析，結果如圖6所示。

1.ADD 2.AD

根據(jù)標準曲線(標準品ADD摩爾濃度與254 nm下光吸收值之間的關系曲線)，積分計算峰面積，比上各自的消光系數(shù)，就可以推算出轉化率。經(jīng)計算，反應2 h，約17%的AD轉化為ADD。張藝[16]報道簡單節(jié)桿菌轉化AD的水平為：投入5 mg·L-1底物AD反應 48 h后，轉化率為45%。與之相比，本研究重組菌的活性表現(xiàn)良好。但是，Li等[11]報道，轉化簡單節(jié)桿菌kstD的重組枯草桿菌48 h轉化1 g·L-1AD的轉化率為45.3%。因此，重組大腸桿菌離生產(chǎn)應用仍存在一定差距，這可能是因為大腸桿菌沒有甾體物質(zhì)主動運輸機制，且甾體物質(zhì)的水溶性很差，因此其傳質(zhì)和反應效率無法與那些可以主動攝取甾體的生產(chǎn)菌株(如分支桿菌、鏈霉菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌和絲狀真菌等)相比較。

2.6 大腸桿菌表達KstDF的酶動力學參數(shù)測定

以HPLC法檢測大腸桿菌以AD為底物表達KstDF的酶動力學參數(shù)。取一定量粗酶液加入不同濃度的底物AD，將反應液在30 ℃、200 r·min-1條件下培養(yǎng)15 min。加乙酸乙酯終止反應，萃取代謝產(chǎn)物進行HPLC分析?；贚ineweaver and Burk方法對實驗數(shù)據(jù)作圖，x軸為1/[AD]、y軸為1/v。根據(jù)雙倒數(shù)法公式，Km等于x軸截距的倒數(shù)的負數(shù)，計算得Km值為0.2 mmol·L-1。Mycobacteriumsp.VKM Ac-1817D以9-OH-AD為底物表達KstD時Km值為(0.81±0.20)mmol·L-1，由于AD的水溶性更低，Km值必然更高[17]。相比之下，本實驗KstDF與底物AD顯示出較好的親和力。

圖7 BL21-pET28a-kstDF表達KstD反應動力學雙倒數(shù)圖

2.7 討論

從A.fumigatus克隆出一個真菌來源的kstDF基因，首次鑒定了該基因的3-甾酮-Δ1-脫氫酶功能。該基因編碼596個氨基酸，與該基因同源性最高的是來源于玫瑰色熱微菌(Thermomicrobiumroseum) DSM 5159的kstD，兩者氨基酸序列一致性為51%。與細菌來源的KstD比對后發(fā)現(xiàn)kstDF的氨基酸序列包含相似FAD結合結構域和活性中心。

關于3-甾酮-Δ1-脫氫酶的研究報道很多，其中功能基因得到鑒定的3-甾酮-Δ1-脫氫酶包括簡單節(jié)桿菌[5]、珊瑚諾卡氏菌[18]、灰暗諾卡氏菌[19]、偶發(fā)分枝桿菌[7]和紅串紅球菌[6]等。但是以上KstD的研究都是局限在細菌范圍內(nèi)，沒有出現(xiàn)過關于真菌KstD的報道。基于Lodeiro等[14]報道的煙曲霉產(chǎn)煙曲霉酸基因簇序列，以及對煙曲霉酸結構的分析，本實驗推測KstDF負責煙曲霉酸C1，2位脫氫反應。通過克隆和大腸桿菌異源表達實驗，KstDF顯示不同于細菌來源KstD的特點，在大腸桿菌中表現(xiàn)良好的活性。分析原因可能是與細菌來源的膜蛋白相比[5，7，20，21]，真菌來源KstDF溶解性較好，結合并催化等量甾體物質(zhì)的相對酶濃度更高，從而表現(xiàn)出良好的生物學活性。本研究首次鑒定了一個真菌來源KstD，該酶具有將AD脫氫轉化為ADD的活力。通常真菌中具有龐大的甾體轉化相關的基因，但很少被了解和研究。本研究為開發(fā)真菌資源在科研和應用方面的價值奠定了基礎。

3 結論

以煙曲霉(A.fumigatus)為出發(fā)菌株，運用同源序列比對從煙曲霉酸基因簇中釣取出kstDF序列。該基因與玫瑰色熱微菌(Thermomicrobiumroseum) DSM 5159的kstD一致性為51%。構建pET28a(+)-kstDF表達載體，轉化大腸桿菌(Escherichiacoli) BL21(λDE3)，獲得高表達重組子菌株。經(jīng)IPTG誘導、SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)高溫(37 ℃)有利于KstDF蛋白表達，低溫(20 ℃)有利于酶活的保持。實驗中該重組菌顯示出良好的甾體轉化能力，在12 h內(nèi)完全轉化13.3 mg·L-1雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD)，為構建高效轉化3-酮基-4-烯類固醇的基因工程菌奠定了基礎。

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