王春鋒 李濟宇 (上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院普外科,上海200092)

過去對肥大細胞(Mast cell,MC)的研究多關(guān)注于其在超敏反應(yīng)像支氣管哮喘、接觸性皮炎等疾病中的作用[1]。自從2006年LU等[2]首次發(fā)現(xiàn)肥大細胞缺陷小鼠難以誘導皮膚移植耐受,輸注骨髓源性MC重建MC正常鼠移植耐受得以誘導,證明了肥大細胞在器官移植耐受中的關(guān)鍵作用[3]。MC參與免疫耐受的相關(guān)機制尚不明確,近年研究多關(guān)注其與調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Treg)的相互作用,且更多關(guān)注Treg對MC的作用,MC對Treg的研究較少,對其他免疫相關(guān)細胞的研究也較少[4,5]。體外獲得大量高純度的肥大細胞可以幫助我們更好的研究其在移植免疫耐受領(lǐng)域的作用。然而骨髓來源的MC所需培養(yǎng)時間較長,需要在特定細胞因子下誘導分化,所需的費用較高,因此,本研究通過采取七天換液的方式來觀察是否可以獲得同樣高純度的MC。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 BALB/c小鼠8～10周齡,清潔級,購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司,許可證號:SCXK(滬)2007-0005。

1.2 主要試劑 小鼠重組IL-3、SCF(Peprotech);RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、非必需氨基酸(Invitrogen);PE-CD117、FITC-FCεR Ⅰα(eBioscience)、PE-murine control mIgG1(eBioscience);甲苯胺藍(上海源葉生物科技有限公司)。

1.3 小鼠骨髓來源肥大細胞的獲得 取小鼠的股骨,剔除其肌肉組織,剪斷兩端骨骺,用1 ml注射器抽取RPMI1640培養(yǎng)基,將骨髓細胞沖出,直至骨髓腔變白,加入到培養(yǎng)體系中,培養(yǎng)體系含RPMI1640、10%胎牛血清、青鏈霉素各100U/ml、50μmol/L非必需氨基酸、10 ng/ml rmIL-3(recombinant murine IL-3)、10 ng/ml rmSCF(recombinant murine SCF)。

1.4 小鼠骨髓來源肥大細胞的培養(yǎng) 將上述細胞按照106ml-1接種于六孔板中,每孔3 ml培養(yǎng)基,置于37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每七天將懸浮細胞按照106ml-1轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng),4～6細胞分化成熟,四周后收集細胞進行鑒定,分別從形態(tài)學、功能學兩方面來驗證所獲得的細胞為肥大細胞。

1.5 肥大細胞的鑒定

1.5.1 形態(tài)學鑒定 主要是通過光鏡下觀察細胞形態(tài)、電鏡下觀察細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu),以及借用于流式細胞儀來觀察細胞表面CD117和FCεRⅠα的表達。具體方法為六周后收集培養(yǎng)細胞,離心,PBS重懸,調(diào)整細胞濃度為106ml-1,每管取100μl,分別加入0.5 μl的PE-CD117,0.2μl的FITC-FCεRⅠα,其中雙染的同時加入兩種抗體,陰性對照組加入PE-mIgG1,4℃避光孵育30分鐘,用PBA(含 2.5%FBS的PBS)洗兩次,上機檢測。

1.5.2 功能學鑒定 肥大細胞的甲苯胺藍染色:六周后將細胞懸液滴到防脫片(包被有多聚賴氨酸)上,超凈臺內(nèi)風干,用1%pH7.4的甲苯胺藍染液染約30秒,用95%的酒精分色,雙蒸水洗滌后,于光鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下肥大細胞生長狀態(tài)的觀察以及四周后光鏡下的肥大細胞 培養(yǎng)48小時后開始出現(xiàn)貼壁細胞,為長梭形,視野中可見大小不一的懸浮細胞,隨著換液次數(shù)的增加,貼壁細胞越來越少,懸浮細胞逐漸增多,變?yōu)榇笮?、形狀、分布均勻具有折光性的細?高倍鏡下(10×40)可以看見胞膜邊緣有絲狀突起。四周以后這種大小均一的折光性細胞占95%以上,見圖1。

2.2 透射電鏡下觀察肥大細胞 電鏡下發(fā)現(xiàn)肥大細胞胞體大部分呈橢圓形或不規(guī)則形,表面有偽足,胞內(nèi)含有豐富的細胞器,如線粒體、游離核糖體、高爾基復(fù)合體等,胞漿內(nèi)充滿大量高電子密度顆粒,有些肥大細胞在未受任何刺激的情況下也會發(fā)生脫顆粒,可見大量脫顆粒后的空泡(如圖2D)。鏡下可見明顯的核仁,異染色質(zhì)附于核膜下,見圖2。

圖1 培養(yǎng)四周后光鏡下的肥大細胞Fig.1 Characteristic of mast cells after 4 weeks'cultureunder light microscope

圖2 不同倍數(shù)電鏡下的骨髓來源肥大細胞Fig.2 Characteristic of mast cells after 4 weeks'cultureunder transmission electron microscope

圖3 流式細胞儀檢測骨髓來源肥大細胞的表面 CD117和FCεRⅠα的表達Fig.3 CD117 and FCεRⅠαexpression on mast cell surface by flow cytometry analysis

圖4 骨髓來源肥大細胞的甲苯胺藍染色Fig.4 Toluidine bluestaining of bone marrow mast cells

2.3 流式細胞儀監(jiān)測分析肥大細胞 四周后收集肥大細胞,應(yīng)用流式細胞儀檢測表面分子CD117和FCεRⅠα的表達情況,單陽性表達CD117和FCεRⅠα的細胞達到90%以上,見圖3A、B,雙陽性表達這兩種表面分子的細胞達81%,見圖3C。

2.4 肥大細胞的甲苯胺藍染色 培養(yǎng)四周后,用甲苯胺藍染色,可以觀察到細胞質(zhì)被染成紫紅色,胞核染成藍色。證實該細胞有吞噬甲苯胺藍的特性,所獲得的細胞為肥大細胞,見圖4。

3 討論

IL-3和SCF都是肥大細胞分化和增殖所必需的細胞因子[6]。在骨髓前體細胞向肥大細胞的轉(zhuǎn)化過程中,一方面,IL-3和SCF在誘導轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用;另一方面,肥大細胞作為懸浮細胞的特性進一步將其與骨髓中的其他細胞(大部分為貼壁細胞)純化開來。很多研究認為在肥大細胞的培養(yǎng)過程中每四天換液可以獲得較純化的細胞[7]。而我們的研究發(fā)現(xiàn),在四周左右時七天換液的細胞較四天換液的細胞純度更高(CD117、FCεRⅠα雙陽性率更高),而細胞的生存活力和細胞數(shù)目沒有明顯的差異。分析原因可能是肥大細胞作為懸浮細胞對培養(yǎng)基更換的頻率沒有那么高,再者肥大細胞的壽命比較長,一些貼壁細胞對培養(yǎng)基的要求較高,在七天的時間內(nèi)大部分死亡,換液過程中純化出了培養(yǎng)體系。通過這種方法,我們可以更經(jīng)濟、更快速的獲得純化的肥大細胞。這種方式獲得的肥大細胞的壽命很長,一般培養(yǎng)十周左右細胞走向凋亡過程。

本研究通過將骨髓細胞直接沖出接種于培養(yǎng)基中,每七天換液的方式獲得了大量CD117和 FCεRⅠα表達雙陽性的細胞,即為肥大細胞。通過形態(tài)學和功能學兩方面鑒定了培養(yǎng)所獲得的細胞為肥大細胞,相對于四天換液明顯節(jié)省了人力和財力,成為一種簡單經(jīng)濟的體外獲得大量肥大細胞的方法,可以更好的研究其在移植免疫領(lǐng)域的作用。

1 Gregory G D,Brown M A.Mast cells in allergy and autoimmunity:implication for adaptive immunity[J].Methods Mol Biol,2006;315(10):35-50.

2 LU L F,Lind E F,Gondek D C et al.Mast cells are essential intermediaries in regulatory T cell tolerance[J].Nature,2006;442(7106):997-1002.

3 Kashyap M,Thornton A M,Norton SK et al.Cutting edge:CD4 T cellmast cell interactions alter IgE receptor expression and signaling[J].J Immunol,2008;180(4):2039-2043.

4 Zhang W,Wu K,He W et al.Transforming growth factor beta 1 plays an important rolein inducing CD4+CD25+forhead box P3+regulatory T cells by mast cells[J].Clin Exp Immunol,2010;161(3):490-496.

5 Gri G,Piconese S,Frossi B et al.CD4+CD25+regulatory Tcells suppress mast cell degranulation and allergic responsesthrough OX40-OX40Linteraction[J].Immunity,2008;29(5):771-781.

6 Haig DM,Huntley J F,Mackellar A et al.Effectsof stem cell factor and interleukin-3 on the growth and serine proteinase expression of rat bonemarrow-derived or serosal mast cells[J].Blood,1994;83(1):72-83.

7 Norton S K,Barnstein B,Brenzovich J et al.IL-10 suppresses mast cell IgE receptor expression and signaling in vitro and in vivo[J].JImmunol,2008;180(5):2848-2854.