李海英，梁志偉，陳 沖，黃華宏，童再康，盧泳全

（浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300）

植物遺傳資源是物種多樣性保護(hù)及品種選育的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。理論上保存的遺傳資源越多越好，但種質(zhì)資源保存過多會耗費巨大的人力物力，也難以對所保存的材料進(jìn)行合理評價，制約了種質(zhì)的利用。因此，F(xiàn)rankel于1984年提出了核心種質(zhì)（core collection）的概念[1]，即以最少數(shù)量的種質(zhì)材料代表一個物種及其近緣野生種最大限度的遺傳多樣性。核心庫中入選的遺傳材料都要有代表性，并包括盡可能多的遺傳多樣性。

構(gòu)建核心種質(zhì)庫主要涉及兩方面的內(nèi)容，一是構(gòu)建核心種質(zhì)所采用的抽樣方法；二是核心種質(zhì)遺傳多樣性的評價指標(biāo)。在傳統(tǒng)的方法中，一般是以形態(tài)學(xué)及農(nóng)藝性狀為評價指標(biāo)[2～4]。但是，由于木本植物形態(tài)學(xué)性狀觀察周期長，與經(jīng)濟(jì)價值相關(guān)的材性性狀往往需要幾十年的時間才能準(zhǔn)確觀測，因而制約了多年生木本植物核心種質(zhì)庫的構(gòu)建。目前，只在白樺[5]、臘梅[6]和棗[7]等幾個物種中有相關(guān)報道。

近年來，隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，分子標(biāo)記越來越多地應(yīng)用到種質(zhì)資源研究中。由于分子標(biāo)記是以個體間遺傳物質(zhì)—核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平遺傳變異的直接反映。因此，在生物發(fā)育的不同階段，不同組織的DNA都可用于遺傳資源的標(biāo)記分析[8]。由于分子標(biāo)記所揭示的多態(tài)性不受外界環(huán)境和內(nèi)在發(fā)育階段的影響，所以非常適于多年生木本植物種質(zhì)資源的早期/幼苗期鑒定。劉勇等[9]利用分子標(biāo)記技術(shù)確立了柚的核心種質(zhì)資源。研究結(jié)果表明，核心種質(zhì)能代表初始種質(zhì)群。

光皮樺（Betula luminifera）是我國南方山地常見的優(yōu)良速生用材闊葉樹種，耐貧瘠，生長快，材質(zhì)好，是一種極具推廣價值的造林樹種。本研究于2005年和2006年分別從浙江、廣西、福建、貴州四省的9個光皮樺天然種源采集種子，溫室內(nèi)種植。實生苗生長1 a后，采優(yōu)株穗條嫁接于浙江農(nóng)林大學(xué)光皮樺種質(zhì)園。目前，該種子園共有材料519份。本研究旨在利用分子標(biāo)記技術(shù)，從這些資源中篩選具有代表性的核心資源，為光皮樺種質(zhì)資源的合理保存及早期利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 初始種質(zhì)的選取

本實驗采用分組取樣法，根據(jù)種源差異將整個群體分為9個組（見表1）。然后組內(nèi)采用隨機(jī)取樣，結(jié)合組內(nèi)個體的表現(xiàn)型差異大小確定各組的取樣比例。最終，從519份共9組光皮樺樣本中抽取62份作為初始種質(zhì)。于2009年5月，取正常生長的嫩葉，采用CTAB＋硅珠吸附法[10]提取葉片總DNA。

表1 光皮樺種源地理位置Table 1 Geographic location of samples

1.2 分子標(biāo)記方法

采用由本實驗室開發(fā)的擴(kuò)增共有序列遺傳標(biāo)記（Amplified Consensus Genetic Markers, ACGM）分子標(biāo)記[11]對光皮樺進(jìn)行遺傳多樣性分析，共得到137個多態(tài)性位點。以1和0記錄等位基因的有和無，獲得矩陣。利用系統(tǒng)分析軟件POPGENE 32計算居群的多態(tài)位點數(shù)、多態(tài)位點百分率（percentage of polymorphic belt, PPB%）、觀測等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei基因多樣性指數(shù)和 Shannon信息指數(shù)[9]，按類平均數(shù)聚類方法（UPGMA）進(jìn)行聚類，得到UPGMA系統(tǒng)樹。

1.3 柚類核心種質(zhì)構(gòu)建方法

利用ACGM所得到的譜帶進(jìn)行聚類分析，按照聚類分析結(jié)果并結(jié)合形態(tài)學(xué)性狀，將遺傳相似系數(shù)最大的2個種質(zhì)刪除1份，剩余的種質(zhì)再聚類；再從遺傳相似系數(shù)最大的成對種質(zhì)中刪除一份。以此類推，直到代表性或核心種質(zhì)量達(dá)到要求。利用上述方法分別抽取41、36、27、18和9個樣品組成核心樣本群進(jìn)行分析比較，各樣品群代號分別為I、II、III、IV、V。

樣品群 I（41 個樣本）代號為：2，3，4，5，6，7，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，20，21，22，26，27，28，30，31，37，38，41，43，44，46，47，48，50，57，58，59，60，61，62，64，65。

樣品群 II（36 個樣本）代號為：3，4，5，6，7，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，20，21，26，27，30，31，37，38，41，43，44，46，47，48，58，59，60，61，62，64，65。

樣品群 III（27 個樣本）代號為：4，5，6，9，10，11，14，15，16，17，18，21，27，30，31，41，43，44，48，58，59，62，64，65。

樣品群IV（18個樣本）代號為：4，5，9，10，11，14，15，17，18，27，30，31，43，44，58，59，64，65。

樣品群V（9個樣本）代號為：5，10，14，17，27，30，44，58，64。

1.4 核心種質(zhì)的評價

構(gòu)建好核心種質(zhì)后，用多態(tài)位點數(shù)、多態(tài)位點百分率、觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)評價指標(biāo)來評價核心種質(zhì)。利用Microsoft Excel中的分析數(shù)據(jù)庫，對初始種質(zhì)和核心種質(zhì)的觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)進(jìn)行t檢驗[9]，根據(jù)檢驗結(jié)果來評價核心種質(zhì)。

圖1 9個居群UPGMA聚類Figure 1 UPGMA dendrogram among 9 populations

2 結(jié)果與分析

2.1 初級種質(zhì)的遺傳多樣性分析

通過PopGen32[9]軟件分析得到居群聚類結(jié)果（圖1），臨安（pop1）和修文（pop7）最先聚在一起，然后川天（pop5）、花坪（pop6）、川普（pop4）、武夷山（pop8）、麗水（pop3）、安徽（pop9）和浙石（pop2）依次相聚。從光皮樺種源的地理分布上看，修文（pop7）、川天（pop5）、花坪（pop6）和川普（pop4）位于我國西南地區(qū)的貴州、四川和廣西三省，而武夷山（pop8）、麗水（pop3）、安徽（pop9）和浙石（pop2）來源于我國東南地區(qū)的福建、浙江和安徽三省。由此可見，本研究的聚類結(jié)果與光皮樺各種源的地理分布是相符的。

2.2 各樣本群的遺傳多樣性比較

利用 PopGen32軟件分析各樣本群的多態(tài)性位點數(shù)、多態(tài)性位點百分率、觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei遺傳多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)(結(jié)果見表2)。比較不同取樣數(shù)目所獲得的各種遺傳參數(shù)，結(jié)果表明，樣品群II的有效等位基因數(shù)是最高的，多態(tài)性位點數(shù)、多態(tài)性位點百分率、觀測等位基因數(shù)、Nei遺傳多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)等僅比樣品群I的稍低，考慮到取樣數(shù)的問題，我們把樣本群II列為核心種質(zhì)。最后獲得的核心種質(zhì)的編號為：3，4，5，6，7，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，20，21，26，27，30，31，37，38，41，43，44，46，47，48，58，59，60，61，62，64，65。

表2 各個樣品群的遺傳多樣性分析Table 2 Analysis of genetic diversities among different sampling groups

2.3 核心種質(zhì)的評價

用 PopGen32軟件比較初始種質(zhì)與核心種質(zhì)的觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei遺傳多樣性指數(shù)、Shannon 信息指數(shù)和多態(tài)性位點百分率（結(jié)果見表3），并對兩個群體的各參數(shù)進(jìn)行t測驗（結(jié)果見表4）。從表3可看出核心種質(zhì)保留了初始種質(zhì)58.06%的樣品，多態(tài)性位點保留率達(dá)到了96%，觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei遺傳多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)的保留率分別為 98.58%、99.88%、98.74%、98.30%。由 t測驗的結(jié)果可表明，核心種質(zhì)的觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei遺傳多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)在概率0.01水平上與初始種質(zhì)差異不顯著，核心種質(zhì)能很好的代替初始種質(zhì)。

表3 初始種質(zhì)與核心種質(zhì)遺傳多樣性對比Table 3 Comparision of the genetic diversities between primary sample and core collection

表4 初始種質(zhì)與核心種質(zhì)t測驗結(jié)果Table 4 t-test result between initial collection and core collection

3 討論

在構(gòu)建核心種質(zhì)時，抽樣比例很重要。目前，多數(shù)植物核心種質(zhì)的抽樣比例為全部收集種質(zhì)的5% ～ 30%，一般為10%左右[12]。但是因為生物進(jìn)化及人工選擇對作物干預(yù)的存在，產(chǎn)生了各個物種的特性，所以對整體的取樣比例不能簡單格式化，應(yīng)視研究作物的遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性而定。在本研究中，構(gòu)建初始種質(zhì)時，抽樣比例為12%，與多數(shù)植物核心種質(zhì)的抽樣比例適當(dāng)。但是在構(gòu)建核心種質(zhì)時，因為光皮樺初始種質(zhì)的樣本數(shù)量較少，只有62份，所以得到的核心種質(zhì)的比例為初始種質(zhì)的58.06%。

抽樣技術(shù)也很重要，直接關(guān)系到核心庫的好壞。常用的組內(nèi)取樣法有按分層抽樣[13]、遺傳差異取樣[14]、組內(nèi)隨機(jī)取樣[15]、多次聚類抽樣[16]等方法。本實驗中采用組內(nèi)隨機(jī)取樣，先按聚類分析分組，再從各組隨機(jī)抽取樣品得到光皮樺核心種質(zhì)，最后通過 t檢驗，證明本研究得到的核心種質(zhì)能很好的代表原光皮樺資源群體的遺傳變異和遺傳結(jié)構(gòu)。

[1]Frankel O H. Genetic Manipulation : Impact on Man And Society[M]. Cambridge Uni Press，1984. 161－170.

[2]Brown A H D. The use of plant genetic resources [A]. Brown A H D,Frandel O H,Marshall R D,et al. [C]. England: Cambridge Univ Press,1989.

[3]Corley Holbrook C, William F Anderson. Evaluation of a core collection to identify resistance to late leafspot in peanut[J]. Core Science，1995（35）：1700－1702.

[4]沈金雄，郭慶元，張秀榮，等. 中國芝麻種質(zhì)資源的聚類分析[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1995，14（6）：532－536.

[5]魏志剛，高玉池，劉桂豐，等. 白樺核心種質(zhì)的初步構(gòu)建[J]. 林業(yè)科學(xué)，2009，45（10）：74－78.

[6]趙冰. 臘梅種質(zhì)資源遺傳多樣性與核心種質(zhì)構(gòu)建的研究[D]. 北京：北京林業(yè)大學(xué)，2008.

[7]董玉慧. 棗樹農(nóng)藝性狀遺傳多樣性評價與核心種質(zhì)構(gòu)建[D]. 石家莊：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[8]李麗，何偉明，馬連平，等. 用EST-SSR分子標(biāo)記構(gòu)建大白菜核心種質(zhì)及其指紋圖譜[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009，28（1）：76－88.

[9]劉勇，孫中海，劉德春，等. 利用分子標(biāo)記技術(shù)選擇柚類核心種質(zhì)資源[J]. 果樹學(xué)報，2006，23（3）：339－345.

[10]張博，張露，諸葛強(qiáng)，等. 一種高效的樹木總DNA的提取方法[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2004，28（1）：13－15.

[11]Yongquan Lu，Haiying Li，Xi Chen，et al. Development amplication concensus genome markers in Betula luminifera based on Birch EST database[J]. Wood Res, 2011, 56（2）：169－178.

[12]李自超，張洪亮，曹永生，等. 中國地方稻種資源初級核心種質(zhì)取樣策略研究[J]. 作物學(xué)報，2003，29（1）：20－24.

[13]劉三才，鄭殿升，曹永生，等. 普通小麥核心種質(zhì)抽樣方法的比較[J]. 麥類作物學(xué)報，2001，21（2）：42－45.

[14]徐海明，胡晉，朱軍. 構(gòu)建作物種質(zhì)資源核心庫的一種有效抽樣方法[J]. 作物學(xué)報，2000，26（2）：157－162.

[15]魏興華，顏啟傳，應(yīng)存山，等. 建立浙江地方秈稻種資源的核心樣品研究[J]. 中國水稻學(xué)，1999，13（2）：81－85.

[16]HU J，Zhu J，Xu H M. Methods of constructing core coolletions by stepwise clustering with three sampling strategies based on the genotypic values of crops[J]. Theor Appl Genet，2000（101）：264－268.