鄒放君， 唐 斌， 何 芳， 劉 成， 王 剛， 張 強(qiáng)，盧賢貴， 黃 剛， 石曉鵬， 楊建峰， 鄧峰美

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002;2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832008;3成都醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，四川 成都 610083)

原發(fā)性高血壓(essential hypertension，EH)是一種常見(jiàn)的嚴(yán)重影響人類(lèi)健康的多基因遺傳性疾病，發(fā)病是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。1991年我國(guó)的高血壓普查，15歲及以上人口中高血壓患病率為11.88%，新疆漢族高血壓患病率為13.88%，高于我國(guó)平均發(fā)病率11.88%，而高血壓的發(fā)病機(jī)制尤其新疆漢族高血壓高發(fā)的遺傳因素有待進(jìn)一步闡明。內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)基因是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的EH的易感基因，由于其對(duì)血壓調(diào)節(jié)的重要作用而備受重視。目前國(guó)內(nèi)外已有研究發(fā)現(xiàn)eNOS基因多態(tài)性與高血壓有密切關(guān)系［1－4］。eNOS基因目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 10 多種SNP位點(diǎn)，一個(gè)染色體區(qū)域可以有很多SNP位點(diǎn)，但是只用少數(shù)幾個(gè)具有代表性的標(biāo)簽SNP(tagging single nucleotide polymorphism，tSNP)就能夠提供該區(qū)域內(nèi)大多數(shù)的遺傳多態(tài)模式，這樣將大大減少用于基因型與疾病關(guān)聯(lián)分析中的SNP，增加SNP分型有效性。關(guān)于eNOS基因標(biāo)簽多態(tài)性與新疆漢族原發(fā)性高血壓的關(guān)系目前未見(jiàn)報(bào)道，本文采用tSNP(包括rs2070744、 rs1800779、 rs1799983、 rs3918188 和rs7830)方法，運(yùn)用分子生物學(xué)手段，分析新疆漢族人群eNOS基因多態(tài)性，闡明連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)模式以及tSNP構(gòu)成的單體型分布特征，揭示新疆漢族EH的分子遺傳易感機(jī)制。

材料和方法

1 研究對(duì)象

樣本來(lái)源于2006－2008年在新疆天山北麓塔城地區(qū)沙灣縣博爾通古鄉(xiāng)牧區(qū)的元興宮村、紅土莊子村及烏蘭烏蘇鎮(zhèn)進(jìn)行高血壓病流行病學(xué)調(diào)查時(shí)采集的漢族人群樣本，選擇本地居住的漢族居民，無(wú)血緣關(guān)系，無(wú)異族通婚史，高血壓患者346例，其中男148例，女198例，年齡18－68歲，對(duì)照組385例，男142例，女243例，年齡18－62歲。原發(fā)性高血壓樣本采集按照1999年10月WHO/ISH頒布診斷標(biāo)準(zhǔn):收縮壓≥140 mmHg或舒張壓≥90 mmHg，排除繼發(fā)性高血壓、心肌病、心肌梗死、瓣膜性心臟病、先天性心臟病、過(guò)量飲酒、甲狀腺疾病、肝腎功能不全、糖尿病、孕婦、哺乳期及口服避孕藥婦女。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn):查體健康者，收縮壓＜140 mmHg和舒張壓＜90 mmHg，無(wú)服用降壓藥史、高血壓家族史及其它器質(zhì)性心臟病史等。

2 調(diào)查內(nèi)容

采用統(tǒng)一的調(diào)查表以1對(duì)1的形式進(jìn)行調(diào)查研究，測(cè)量身高、體重、腰圍、臀圍，計(jì)算體重指數(shù)［body mass index，BMI=體重(kg)/身高2(m2)］和腰臀比［waist to hip ratio，WHR=腰圍(cm)/臀圍(cm)］，詢(xún)問(wèn)職業(yè)、文化程度、婚姻狀況、吸煙、飲酒、飲食習(xí)慣、性格特點(diǎn)、疾病及家族史等，抽血臨床檢測(cè)血糖、血脂(甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白)等生化指標(biāo)。

3 基因組DNA提取

實(shí)驗(yàn)前夜禁食12 h以上。次晨抽取空腹血液標(biāo)本10 mL，用肝素和EDTA抗凝管，分離血樣，血漿當(dāng)天做生化檢測(cè)。血液用酚－氯仿法進(jìn)行DNA抽提。

4 eNOS基因目的片段擴(kuò)增

設(shè)計(jì)PCR引物用于擴(kuò)增包含SNP位點(diǎn)的片段，緊鄰SNP位點(diǎn)的延伸引物用于單堿基延伸。檢索美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心公共數(shù)據(jù)庫(kù)中SNP位點(diǎn)序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物及延伸引物，分別見(jiàn)表1、表2。PCR反應(yīng)體系:DNA模板1 μL，HotStar Taq 聚合酶 0.2 μL，10 × buffer 2 μL，25mmol/L MgCl21.2 μL，dNTP 0.6 μL，多重 PCR 引物 2 μL，去離子水 13 μL，總體系 20 μL。利用 ABI公司的2720 Thermal Cycler預(yù)變性94℃ 5 min，94℃ 30 s，59 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s，35 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃10 min。

表1 PCR引物序列與擴(kuò)增參數(shù)Table 1.PCR primer sequences and amplification parameters

5 eNOS基因片段多態(tài)性檢測(cè)

利用SNaPshot SNP分型技術(shù)進(jìn)行SNP位點(diǎn)分型。PCR產(chǎn)物延伸反應(yīng)即單堿基延伸反應(yīng)。延伸反應(yīng)體系(10 μL)包括2 μL純化后PCR產(chǎn)物，5 μLSNaPshot Multiplex Kit(ABI)，1 μL 延伸引物，2 μL超純水。PCR循環(huán)程序:96℃預(yù)變性1 min;28×(96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃ 30 s);60℃ 充分延伸1 min;4℃保存。延伸產(chǎn)物純化，在10 μL延伸產(chǎn)物中加入1 U Taq酶，37℃溫浴1 h，然后75℃滅活15 min。取 0.5 μL 純化后的延伸產(chǎn)物，與 0.5 μL LIZ120 Size Standard，9 μL Hi－Di混勻，95 ℃變性5 min后上ABI 3130XL測(cè)序儀，收集的原始數(shù)據(jù)用GeneMapper 4.0(Applied Biosystems)來(lái)分析，進(jìn)行基因型判斷。

表2 單堿基延伸引物序列Table 2.Single－base extension primer sequences

6 tSNP選擇

依據(jù)HapMap的數(shù)據(jù)庫(kù)及位點(diǎn)間的LD程度(D'＞0.8，r2＞0.8為標(biāo)準(zhǔn))，以10%頻率為界，并考慮SNP的功能，選擇的tSNP為5個(gè)，分別為:位于啟動(dòng)區(qū)的rs2070744，第7外顯子的rs1799983，第1內(nèi)含子的rs1800779，第5內(nèi)含子的rs3918188，第12內(nèi)含子的rs7830。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。病例組與對(duì)照組計(jì)量資料比較用t檢驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。進(jìn)行Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)確認(rèn)研究樣本的群體代表性，計(jì)數(shù)資料比較用卡方檢驗(yàn)，病例組與對(duì)照組基因型與等位基因分布頻率差異比較用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。連鎖不平衡及單體型分析分別采用Data Analyser 0.34和Phase 2.1軟件。D'(連鎖不平衡系數(shù))＜0.2被認(rèn)為不具有連鎖不平衡，D'＞0.5具有連鎖不平衡，D'＞0.8具有強(qiáng)連鎖不平衡，D'=1處于完全連鎖不平衡;r2代表相關(guān)系數(shù)。Logistic回歸分析各危險(xiǎn)因素與高血壓的關(guān)系。

結(jié) 果

1 研究對(duì)象一般情況

各指標(biāo)如收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓、脈壓、體重指數(shù)、腰臀比、膽固醇、低密度脂蛋白、肌酐、尿酸、載脂蛋白A1/B的平均水平，兩組間比較均有顯著差異(P＜0.05)，EH組均高于對(duì)照組;其余指標(biāo)如年齡、性別、空腹血糖、甘油三酯、高密度脂蛋白、載脂蛋白－A1、載脂蛋白 －B兩組間均無(wú)差異(P＞0.05)，見(jiàn)表3。

表3 新疆漢族EH組與正常對(duì)照組臨床相關(guān)指標(biāo)比較Table 3.Comparison of clinical characteristics between essential hypertension(EH)and healthy subjects in the Han population of Xinjiang

2 eNOS基因位點(diǎn)基因型及等位基因在新疆漢族EH組與對(duì)照組中的分布及患病風(fēng)險(xiǎn)估計(jì)

eNOS基因tSNP位點(diǎn)基因型分布均符合Hardy－Weinberg平衡(P＞0.05)，提示該人群有較好的代表性。表4中eNOS基因rs3918188位點(diǎn)等位基因C、A在 EH組和對(duì)照組中分布頻率分別為 485(70.1%)、207(29.9%)和 497(64.5%)、273(35.5%)，EH組C等位基因頻率高于對(duì)照組，C等位基因患病風(fēng)險(xiǎn)為A等位基因1.287倍(95%CI 1.033－1.603，P＜0.05)，EH組和正常對(duì)照組等位基因分布頻率有顯著差異(P＜0.05)。rs7830位點(diǎn)基因型CC、AC、AA在EH組及正常對(duì)照組中的分布頻率 分 別 為 126(36.4%)、185(53.5%)、35(10.1%)和 145(37.7%)、173(44.9%)、67(17.4%)，EH組和正常對(duì)照組基因型頻率分布有顯著差異(P＜0.01)。其它tSNP位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布在EH組和對(duì)照組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)，見(jiàn)表 4。

表4 新疆漢族高血壓組與對(duì)照組間tSNP位點(diǎn)基因型分布及等位基因頻率比較Table 4.Comparison of genotypic distributions and allele frequencies of tSNPs of eNOS gene between healthy and essential hypertension(EH)subjects in the Han population of Xinjiang

3 新疆漢族人群eNOS基因tSNP位點(diǎn)間連鎖不平衡分析

我們對(duì)5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)分別進(jìn)行了配對(duì)連鎖不平衡分析，采用Data Analyser軟件分析，當(dāng)D'＞0.8且r2＞0.3時(shí)認(rèn)為兩位點(diǎn)間存在強(qiáng)的連鎖不平衡，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)除rs1800779和rs2070744位點(diǎn)間存在強(qiáng)連鎖不平衡外，其它位點(diǎn)間不存在強(qiáng)連鎖不平衡。其D'和r2值分別見(jiàn)表5、圖1。

表5 新疆漢族人群eNOS基因多態(tài)位點(diǎn)間的連鎖不平衡分析Table 5.Linkage disequilibrium analyses of tSNP of eNOS gene in the Han population of Xinjiang

Figure 1.Linkage disequilibrium structure chart of tSNP of eNOS gene.圖1 eNOS基因tSNP位點(diǎn)間連鎖不平衡結(jié)構(gòu)圖

4 新疆漢族人群eNOS基因tSNP單體型分析及患病風(fēng)險(xiǎn)估計(jì)

用Phase 2.1軟件構(gòu)建的新疆漢族總?cè)巳簡(jiǎn)误w型如表6所示，eNOS基因 rs2070744、rs1800779、rs1799983、rs3918188和 rs7830構(gòu)成 12種單體型(TAGAC、TAGCA、TAGCC、CGGCA、TATCC、TAGAA、TATCA、CGGCC、CGTCC、CGGAC、TATAC 和CATCC)。單體型在新疆漢族EH組和對(duì)照組分布如表7所示，單體型TAGAC頻率在EH組低于對(duì)照組，差異顯著(P＜0.05)，單體型TAGCC頻率在EH組高于對(duì)照組(P＜0.05)。而 TAGCA、CGGCA、TAGAA和CGTCC的頻率在EH組低于對(duì)照組，但無(wú)顯著差異，TATCC的頻率在EH組高于對(duì)照組，也無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

表6 新疆漢族e(cuò)NOS基因單體型分布Table 6.Distribution of haplotypes of eNOS gene in the Han population of Xinjiang

表7 eNOS基因單體型在新疆漢族高血壓組和對(duì)照組中的分布Table 7.Distribution of haplotypes of eNOS gene between healthy and essential hypertension(EH)subjects in the Han population of Xinjiang

5 Logistic回歸分析

以有無(wú)高血壓為因變量，體重指數(shù)、腰臀比、年齡、空腹血糖、膽固醇、甘油三酯等為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示體重指數(shù)增大、年齡、高血糖、高脂血癥為高血壓發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表8。

表8 新疆漢族高血壓與其影響因素的Logistic回歸分析Table 8.Logistic regression analysis between influential factor and essential hypertension in the Han population of Xinjiang

討 論

高血壓是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的一種常見(jiàn)病、多發(fā)病，發(fā)病原因尚未完全清楚，它的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜。原發(fā)性高血壓具有遺傳傾向，它是一種多基因遺傳性疾病，其基因表達(dá)在很大程度上受環(huán)境因素的影響。許多研究顯示人群超重和肥胖與血壓升高有關(guān)［5－8］，超重和肥胖是高血壓的危險(xiǎn)因素。久居新疆的漢族居民由于環(huán)境條件、生活方式及飲食習(xí)慣與內(nèi)地漢族存在地域差異。本研究選擇長(zhǎng)期居住在新疆的漢族居民，均生活在邊遠(yuǎn)的牧區(qū)和農(nóng)村，而且冬季時(shí)間較長(zhǎng)，居民喜食肉食，戶(hù)外運(yùn)動(dòng)較少，與內(nèi)地漢族生活環(huán)境和方式不同。本研究高血壓組與對(duì)照組一般資料比較顯示新疆漢族高血壓人群中體質(zhì)指數(shù)、腰臀比、膽固醇及低密度脂蛋白明顯高于正常對(duì)照人群，提示超重、肥胖及血脂異常(包括血漿膽固醇、低密度脂蛋白濃度增高)可能為該地區(qū)漢族高血壓的危險(xiǎn)因素。進(jìn)一步作Logistic回歸分析校正了年齡、性別、BMI及臨床指標(biāo)等混雜因素后，結(jié)果顯示體重指數(shù)增大、年齡、高血糖、血脂異常為該地區(qū)漢族高血壓的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，從而證實(shí)了血脂異常、超重和肥胖與該地區(qū)漢族高血壓的發(fā)生有關(guān)。

本研究中eNOS基因rs2070744位點(diǎn)T、C等位基因與rs1799983位點(diǎn)G、T等位基因頻率在新疆漢族健康對(duì)照人群分布分別為89.1%、10.9%和90.1%、9.9%，而內(nèi)地北方漢族分別為 90.7%、9.3%和89.1、10.9%［9］，兩者多態(tài)性分布無(wú)顯著差異。美國(guó)白種人分別為58.0%、42.0%和65.5%、34.5%，美國(guó)黑種人為82.5%、17.5%與84.5%、15.5%［10］，巴西白種人為58.1%、41.9%和67.2%、32.8%，黑種人為80.5%、19.5%和84.9%、15.1%［11］，巴西印第安人為 96.8%、3.2% 和 95.0%、5.0%［12］，均與本研究結(jié)果eNOS基因rs2070744和rs1799983位點(diǎn)等位基因頻率分布存在差異。

新疆其他民族未見(jiàn)rs2070744位點(diǎn)相關(guān)報(bào)道，新疆維吾爾族人rs1799983位點(diǎn)G、T等位基因頻率分別為77.2%、22.8%［13］，與本研究結(jié)果等位基因頻率分布也存在差異。在上述結(jié)果可以看出上述位點(diǎn)在不同種族人群存在較大的差別。其它位點(diǎn)rs1800779、rs3918188、rs7830等位基因頻率在新疆漢族健康對(duì)照人群分布分別為:A:89.1%，G:10.9%，C:64.5%，A:35.5%，C:60.1%，A:39.9%。而在國(guó)內(nèi)外其他民族少見(jiàn)報(bào)道。eNOS基因rs3918188位點(diǎn)等位基因C、A在EH組和對(duì)照組中分布頻率分別為485(70.1%)、207(29.9%)和497(64.5%)、273(35.5%)，EH組C等位基因頻率高于對(duì)照組(P＜0.05)，C等位基因患病風(fēng)險(xiǎn)為A等位基因1.287倍(95%CI 1.033－1.603，P＜0.05)。rs7830位點(diǎn)基因型CC、AC、AA在EH組及正常對(duì)照組中的分布頻率分別為 126(36.4%)、185(53.5%)、35(10.1%)和 145(37.7%)、173(44.9%)、67(17.4%)，EH組和正常對(duì)照組基因型頻率分布有顯著差異(P＜0.01)。該研究結(jié)果表明rs3918188C等位基因可能是新疆漢族EH的易感因素，rs7830位點(diǎn)多態(tài)性與新疆漢族高血壓相關(guān)。

新疆漢族高血壓組和健康對(duì)照組eNOS基因rs2070744、rs1799983、rs 1800779 位點(diǎn)基因型與等位基因分布頻率無(wú)差異(表4)，可能與以下因素有關(guān):(1)基因突變存在著種族、地理和環(huán)境因素的差異，在上述研究結(jié)果中可以看出不同種族和不同地域多態(tài)分布特征不同，從而影響到與疾病的關(guān)聯(lián);(2)疾病本身的復(fù)雜性，不是單個(gè)位點(diǎn)突變可以解釋的。高血壓病是多個(gè)基因和環(huán)境因素間相互作用導(dǎo)致的復(fù)雜病理過(guò)程，單個(gè)位點(diǎn)突變并不能決定疾病的發(fā)生，而是和其它位點(diǎn)突變以及年齡、吸煙和高血脂等危險(xiǎn)因素共同導(dǎo)致疾病的發(fā)生;(3)研究中樣本量不夠大以及基因之間的連鎖不平衡現(xiàn)象。

連鎖不平衡是指在某一群體中，某2個(gè)等位基因出現(xiàn)在同一條單體型不同SNP位點(diǎn)上的頻率與其預(yù)期的隨機(jī)頻率之間存在明顯差異的現(xiàn)象。連鎖不平衡在關(guān)聯(lián)性分析中起到了重要作用，這是因?yàn)槲覀兛梢酝ㄟ^(guò)致病基因周?chē)奈稽c(diǎn)檢測(cè)到與疾病的相關(guān)性。我們?cè)谛陆疂h族人群中做了5個(gè)位點(diǎn)的連鎖不平衡分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除rs1800779和rs2070744位點(diǎn)間存在強(qiáng)連鎖不平衡外，其它位點(diǎn)間不存在強(qiáng)連鎖不平衡。單體型是指一條染色體上緊密相連的2個(gè)或2個(gè)以上基因座的一組等位基因組成的基因型。單個(gè)SNP進(jìn)行遺傳分析的效力較小，由幾個(gè)連鎖位點(diǎn)組成的單體型則能提供更多更可靠的信息。以單體型為基礎(chǔ)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，比利用單個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)每個(gè)基因的檢測(cè)更為有效，可以增加靈敏性和全面性，更能全面地評(píng)價(jià)候選基因在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。本研究采用Phase 2.1軟件對(duì)新疆漢族人群eNOS基因tSNP構(gòu)成的單體型進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在新疆漢族人群中tSNP構(gòu)成12種單體型，最常見(jiàn)的單體型為T(mén)AGAC(30.23%)、TAGCA(26.13%)和TAGCC(21.41%)。EH組和對(duì)照組分別構(gòu)成11種單體型，其中單體型的TAGAC頻率在EH組低于對(duì)照組(P＜0.05)，單體型的TAGCC頻率在EH組高于對(duì)照組(P＜0.01)。而單體型TAGCA、CGGCA、TAGAA、CGTCC頻率在高血壓組低于對(duì)照組，TATCC頻率在高血壓組高于對(duì)照組，均無(wú)顯著差異。因此，eNOS基因tSNP構(gòu)成的單體型可能與新疆漢族原發(fā)性高血壓相關(guān)。

綜上所述，本研究對(duì)象選擇來(lái)自一個(gè)遺傳和環(huán)境上相對(duì)均質(zhì)的群體，結(jié)果表明在新疆漢族人群中eNOS基因rs3918188C等位基因攜帶者患高血壓的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高，rs7830位點(diǎn)多態(tài)性與新疆漢族高血壓相關(guān)，而其它tSNP可能與該民族EH不相關(guān)。除rs1800779和rs2070744位點(diǎn)間存在強(qiáng)連鎖不平衡外，其它tSNP位點(diǎn)間不存在強(qiáng)連鎖不平衡，tSNP構(gòu)成的單體型可能與新疆漢族EH相關(guān)。由于本研究樣本量有限，還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量證實(shí)本研究結(jié)果。

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