許成芳， 李小毛， 李 田， 王小韻

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦科，廣東 廣州 510630)

子宮內(nèi)膜癌是原發(fā)于子宮內(nèi)膜的一種上皮性惡性腫瘤，是女性生殖道最常見的惡性腫瘤之一。近年來，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)有所上升，但5年生存率卻逐年下降。目前，化療已經(jīng)成為有小殘余病灶的晚期患者和高危早期患者的一線治療方案［1］。

阿霉素(adriamycin，ADM)是傳統(tǒng)的子宮內(nèi)膜癌一線化療藥物，其抗腫瘤機(jī)制主要是嵌入RNA或DNA中而抑制核酸合成，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［2］。阿霉素在臨床上的應(yīng)用日益廣泛，但是阿霉素在治療劑量時(shí)產(chǎn)生非特異性的毒副作用，病人往往很難耐受，大大限制了阿霉素在臨床上的應(yīng)用。因此，減少阿霉素的臨床用量，降低毒副作用已成為成為阿霉素應(yīng)用的關(guān)鍵。大量研究表明特異性抑制PI3K(phosphatidylinositol－3－kinase)/Akt(protein kinase B)通路的活性可減少腫瘤細(xì)胞的化療耐藥性，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是哺乳動(dòng)物 PI3K/Akt通路的下游效應(yīng)物，它通過PI3K/Akt的磷酸化而被活化的，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖凋亡等［3］。以抑制mTOR為主要作用原理的雷帕霉素成為新的抗腫瘤藥物，并進(jìn)入臨床開發(fā)的早期階段［4］。本研究擬將mTOR的抑制劑雷帕霉素(rapamycin，RA)與阿霉素聯(lián)合使用，觀察雷帕霉素是否增強(qiáng)阿霉素在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中敏感性，并探討相關(guān)分子機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa［PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)陰性］細(xì)胞及HEC－1A細(xì)胞(PTEN陽性)由中山三院中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑 胎牛血清購自Gibco;DMEM購自Hyclone;兔抗 p－Akt和caspase－3單抗購自Cell Signaling Technology;鼠抗人PTEN購自Santa Cruz Biotechnology;鼠抗β－actin多克隆抗體購自Sigma;細(xì)胞總蛋白提取試劑盒購自Pierce;蛋白分子量marker購自Fermentas;Annexin V－FITC凋亡試劑盒購自北京寶賽生物技術(shù)有限公司;rapamycin購自Cell Signaling Technology;阿霉素購自Sigma。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Ishikawa及HEC－1A于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件在5%CO2、37℃及飽和濕度下進(jìn)行。

2.2 細(xì)胞處理與分組 將rapamycin溶解在DMSO中，配成100 mmol/L的液體，于實(shí)驗(yàn)當(dāng)天用DMEM培養(yǎng)液稀釋，使DMSO的濃度在0.1%以下。并用培養(yǎng)基稀釋阿霉素。rapamycin稀釋后的濃度為10 nmol/L，阿霉素濃度為1 μmol/L。實(shí)驗(yàn)分為4組:對(duì)照組(培養(yǎng)液+細(xì)胞)、rapamycin組、阿霉素組、rapamycin+阿霉素組。聯(lián)合用藥組為rapamycin作用24 h后再加阿霉素繼續(xù)作用24 h。

2.3 MTT檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖情況及計(jì)算IC50值 以1×104cells/well接種于96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)棄原培養(yǎng)基，加入4組干預(yù)藥物工作液。4組細(xì)胞處理24、48、72 h(每組設(shè) 3個(gè)復(fù)孔 )后，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL繼續(xù)孵育4 h，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀讀取每孔的吸光度(absorbance，A)值。按下式計(jì)算細(xì)胞存活率(%)=A試驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%;細(xì)胞抑制率(%)=(1－A試驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%。繪制細(xì)胞增殖曲線。

2.4 采用金正均法計(jì)算聯(lián)合指數(shù)(combination index，CI)判斷兩藥合用是否具有協(xié)同作用 公式:CI=Ea+b/(Ea+Eb－ Ea×Eb)，公式中Ea+b為聯(lián)合處理組的抑制率，Ea、Eb分別為a藥和b藥單獨(dú)處理的抑制率。若q值在0.85～1.15間為兩藥合用單純相加，若q＞1.15為有協(xié)同作用，若q＜0.85表示兩藥合用有拮抗作用。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 各組細(xì)胞加藥干預(yù)24 h后收集細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞凋亡，培養(yǎng)基+細(xì)胞組作為空白對(duì)照。200 μL binding buffer重懸細(xì)胞，加入 10 μL Annexin V 和 4 μL PI(propidium iodide)，室溫中避光孵育30 min，最后加入300 μL binding buffer，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Cell Quest軟件計(jì)算細(xì)胞凋亡率。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 Western blotting檢測(cè) 提取細(xì)胞蛋白，BCA法定量，取等量樣本上樣于10%SDS－PAGE進(jìn)行電泳分離，并電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，室溫封閉1 h，Ⅰ抗4℃孵育過夜，Ⅱ抗室溫孵育1 h，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)。結(jié)果采用圖形分析軟件Quantity One對(duì)條帶進(jìn)行灰度掃描分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)和方差分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。

結(jié) 果

1 阿霉素、雷帕霉素單獨(dú)及合用對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果表明，阿霉素、雷帕霉素單獨(dú)使用對(duì)Ishikawa細(xì)胞和HEC－1A細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用。抑制率與時(shí)間、劑量呈正相關(guān)。其中，雷帕霉素在Ishikawa細(xì)胞作用 48h的 IC50為(32.4±4.2)nmol/L，在 HEC －1A 細(xì)胞的 IC50為(179.7 ±22.8)nmol/L。阿霉素在Ishikawa細(xì)胞作用24 h的IC50為(21.3±3.8)μmol/L，而在 HEC －1A 細(xì)胞的 IC50為(14.3 ±2.8)μmol/L，見圖1。

Figure 1.The effects of rapamycin(RA)or/and adriamycin(ADM)on proliferation in HEC－1A cells(A)and Ishikawa cells(B)..n=3.圖1 雷帕霉素或/和阿霉素對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖影響

根據(jù)我們前期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，先用雷帕霉素10 nmol/L預(yù)處理24 h，然后用阿霉素處理Ishikawa細(xì)胞和HEC－1A細(xì)胞。結(jié)果顯示，與單用阿霉素組相比，兩藥合用組阿霉素24 h的 IC50分別降至(11.9±1.2)μmol/L(Ishikawa細(xì)胞)和(8.2±0.9)μmol/L(HEC－1A細(xì)胞)，差異顯著(P＜0.05)。阿霉素與雷帕霉素的聯(lián)合指數(shù)在Ishikawa細(xì)胞為1.85，而 HEC －1A 細(xì)胞為 1.47，均大于 1.15，提示阿霉素與雷帕霉素合用在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中有協(xié)同作用。

2 阿霉素、雷帕霉素單獨(dú)或合用對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡率的影響

結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，阿霉素、雷帕霉素單獨(dú)使用時(shí)均能明顯誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的凋亡。雷帕霉素10 nmol/L預(yù)處理24 h后，阿霉素5 μmol/L作用24 h，HEC－1A細(xì)胞的凋亡率為(58.93±5.76)%，Ishikawa細(xì)胞的凋亡率為(48.61±4.35)%，較藥物單用組均有明顯升高，提示阿霉素與雷帕霉素合用能協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，見圖2。

3 阿霉素、雷帕霉素單獨(dú)或合用對(duì)caspase－3和PI3K/Akt磷酸化作用的影響

結(jié)果顯示，雷帕霉素10 nmol/L作用于HEC－1A及Ishikawa細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比，p－Akt及活化的caspase－3蛋白的表達(dá)顯著增強(qiáng)，pmTOR蛋白的表達(dá)明顯減弱。阿霉素5 μmol/L作用于細(xì)胞24 h后，2株細(xì)胞中p－mTOR蛋白的表達(dá)均有不同程度的減弱，活化的caspase－3蛋白表達(dá)增強(qiáng)，其中HEC－1A細(xì)胞的變化更明顯。以上結(jié)果提示阿霉素對(duì)PI3K/Akt通路有抑制的作用，見圖3。

雷帕霉素10 nmol/L預(yù)處理24 h后，阿霉素5 μmol/L濃度再作用24 h，與單藥組相比較，2株細(xì)胞的p－Akt和p－mTOR蛋白的表達(dá)均有進(jìn)一步的下降，活化的caspase－3表達(dá)則顯著增強(qiáng)，差異顯著(P＜0.05)，在 HEC－1A細(xì)胞中這種變化更加明顯。

Figure 2.The effects of RA or/and ADM on apoptosis of endometrial cancer cells.BC:blank control;RA:rapamycin treatment;ADM:adriamycin treatment;RA+ADM:rapamycin in combination with adriamycin treatment..n=3.*P＜0.05 vs RA or ADM.圖2 雷帕霉素或/和阿霉素誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡

討 論

近年來，國外開展了多項(xiàng)針對(duì)早期高危子宮內(nèi)膜癌術(shù)后輔助化療的隨機(jī)對(duì)照研究表明，化療對(duì)預(yù)防早期子宮內(nèi)膜癌復(fù)發(fā)，治療晚期小殘余病灶具有良好的作用［5］。阿霉素是目前常用的治療子宮內(nèi)膜癌的藥物。作為細(xì)胞毒性藥物，其抗腫瘤作用主要是通過引起不可修復(fù)的DNA破壞最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生，然而，作為子宮內(nèi)膜癌的一線化療藥物，該藥嚴(yán)重的毒副作用，以及腫瘤細(xì)胞對(duì)其產(chǎn)生的耐藥性都是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的重要因素。因此，尋找減少耐藥、增強(qiáng)阿霉素療效的方法具有重要的臨床意義［6，7］。

Figure 3.The effects of RA or/and ADM on the expression of p－Akt，caspase－3 and p－mTOR in HEC－1A cells(A)and Ishikawa cells(B).BC:blank control;RA:rapamycin treatment;ADM:adriamycin treatment;RA+ADM:rapamycin in combination with adriamycin treatment..n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs RA or ADM.圖3 雷帕霉素或/和阿霉素對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞p－Akt、caspase－3和p－mTOR蛋白表達(dá)的影響

最近的研究顯示，分子靶向藥物與細(xì)胞毒性藥物聯(lián)合使用能夠降低藥物的使用劑量，增加抗腫瘤藥物的細(xì)胞毒性從而降低腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的耐藥性，提高化療藥物的療效［8－11］。雷帕霉素是大環(huán)內(nèi)酯類的抗生素，也是最早被發(fā)現(xiàn)的mTOR抑制劑，主要通過阻斷腫瘤細(xì)胞的能量來源和有絲分裂過程達(dá)到抗腫瘤作用［12］。本研究結(jié)果證實(shí)，體外應(yīng)用雷帕霉素作用于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC－1A和Ishikawa可起到抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用。同時(shí)，我們研究還發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素與阿霉素聯(lián)合使用抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖效果較兩藥單獨(dú)使用好，這種抑制作用表現(xiàn)為良好的時(shí)間和劑量依賴性，協(xié)同作用明顯。更重要的是，兩藥合用后，阿霉素的IC50明顯降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，提示雷帕霉素能增加阿霉素的細(xì)胞毒性，從而降低阿霉素的起效劑量。作為聯(lián)合用藥，其劑量與用藥順序都很重要。本研究顯示提前24 h使用1/2～1/10的IC50劑量的抑制劑再加用1/4的IC50劑量的阿霉素，就能達(dá)到細(xì)胞抑制50%的效果。以上結(jié)果提示雷帕霉素能夠增強(qiáng)阿霉素抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，在不影響藥物療效的前提下，可以減少阿霉素的臨床用量，減少阿霉素耐藥性的產(chǎn)生，這為開辟新的子宮內(nèi)膜癌臨床化療方案提供了思路。

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不僅與細(xì)胞的增殖、凋亡有關(guān)，而且在腫瘤的生長、對(duì)化療的反應(yīng)方面都扮演著重要角色［13］。特異性抑制 PI3K/Akt/mTOR通路的活性可減少腫瘤細(xì)胞的化療耐藥性，可增強(qiáng)化療效果，因此，PI3K/Akt/mTOR通路可作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)［14，15］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素可以明顯抑制p－Akt的蛋白表達(dá)，而雷帕霉素可以顯著降低mTOR的蛋白水平，兩者合用后整個(gè)PI3K/Akt/mTOR通路的蛋白表達(dá)都下調(diào)，凋亡蛋白活化的caspase－3表達(dá)明顯增強(qiáng)。阿霉素與雷帕霉素分別作用于信號(hào)通路的不同環(huán)節(jié)，充分抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，可能是兩藥合用產(chǎn)生協(xié)同作用的機(jī)制。

綜上所述，雷帕霉素與阿霉素聯(lián)合使用能夠降低阿霉素在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的使用劑量，協(xié)同增加子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性從而降低腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的耐藥性，為提高阿霉素在臨床的療效提供了一個(gè)很好方案。

［1］Expand Humber CE，Tierney JF，Symonds RP，et al.Chemotherapy for advanced，recurrent or metastatic endometrial cancer:a systematic review of Cochrane collaboration［J］.Ann Oncol，2007，18(3):409 －420.

［2］Indermaur MD，Xiong Y，Kamath SG，et al.Genomicdirected targeted therapy increases endometrial cancer cell sensitivity to doxorubicin［J］.Am J Obstet Gynecol，2010，203(2):158.e1 －158.e40.

［3］Ma XM，Blenis J.Molecular mechanisms of mTOR－mediated translational control［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2009，10(5):307－318.

［4］Sabatini DM.mTOR and cancer:insights into a complex relationship［J］.Nat Rev Cancer，2006，6(9):729 －734.

［5］Hogberg T.Adjuvant chemotherapy in endometrial cancer［J］.Clin Oncol，2008，20(4):463 －469.

［6］Temkin S M，F(xiàn)leming G.Current treatment of metastatic endometrial cancer［J］.Cancer Control，2009，16(1):38－45.

［7］賴佳明，沈順利，彭寶崗，等.抑制Treg聯(lián)合瘤內(nèi)轉(zhuǎn)染Ad.GM－CSF增強(qiáng)阿霉素治療肝癌效果的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國病理生理雜志，2010，26(10):1879 －1884.

［8］Dancey JE，Chen HX.Strategies for optimizing combinations of molecularly targeted anticancer agents［J］.Nat Rev Drug Discov，2006，8(5):649 －659.

［9］de Groot JF，Gilbert MR，Aldape K，et al.Phase II study of carboplatin and erlotinib(Tarceva，OSI－774)in patients with recurrent glioblastoma ［J］.J Neurooncol，2008，90(1):89 －97.

［10］Nakajima H，Mizuta N，Sakaguchi K，et al.Enhancement of paclitaxel－induced apoptosis in HER2－overexpressing human breast cancer cells by a pertuzumab mimetic peptide，HRAP ［J］.J Biosci Bioeng，2010，110(2):250－253.

［11］Ren Y，Zhou X，Mei M，et al.MicroRNA－21 inhibitor sensitizes human glioblastoma cells U251(PTEN－mutant)and LN229(PTEN － wild type)to taxol［J］.BMC Cancer，2010，10:27.

［12］Dutcher JP.Mammalian target of rapamycin inhibition［J］.Clin Cancer Res，2004，10(18 Pt 2):6382S －6387S.

［13］Murakami D，Tsujitani S，Osaki T，et al.Expression of phosphorylated Akt(pAkt)in gastric carcinoma predicts prognosis and efficacy of chemotherapy［J］.Gastric Cancer，2007，10(1):45 －51.

［14］李 歡，于皆平，于紅剛，等.PI3K/Akt通路抑制劑對(duì)人胃癌細(xì)胞caspase－9表達(dá)的影響［J］.武漢大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2008，29(1):38－40.

［15］傅 深，章 青，孫 宜，等.阻斷PI3K生長路徑可改變前列腺癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞藥物易感性［J］.腫癌防治雜志，2005，12(15):1146－1149.