李尊嶺， 邵淑紅， 焦 飛， 岳 真， 李有杰

(濱州醫(yī)學院1生物化學與分子生物學教研室，分子遺傳學研究所，2應用心理學教研室，山東 煙臺 264003)

ras基因家族主要有3個成員:K－ras、H－ras和 N －ras，分別定位于 12p1、11p15、1p22，其編碼的蛋白質(zhì)主要是高度保守的小G蛋白，該蛋白有188－189個氨基酸組成，定位于細胞膜內(nèi)側(cè)，是控制細胞外向細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑的關鍵“開關分子”［1］。Ras蛋白主要通過以下信號轉(zhuǎn)導途徑，促進細胞的增殖:表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)等信號分子與受體結(jié)合后，受體二聚化，激活其蛋白激酶的活性，使受體自身酪氨酸殘基磷酸化，形成SH2結(jié)構(gòu)域，進而結(jié)合接頭蛋白Grb2，活化SOS(son of sevenless)蛋白;活化的SOS蛋白結(jié)合Ras蛋白，使Ras蛋白釋放GDP，結(jié)合GTP，最終通過Ras/Raf和Rho/Rac通路，促進細胞增殖、抑制細胞凋亡［2］。

K－ras基因的突變和過度表達與肺癌的發(fā)生、發(fā)展和預后有著密切關系。有研究表明，在非小細胞肺癌(non－small cell lung cancer，NSCLC)尤其是腺癌中，60%的K－ras基因存在突變或過表達，主要是第12位密碼子中的鳥嘌呤(G)被胸腺嘧啶(T)取代，從而導致 K－Ras蛋白喪失了GTP酶的活性，持續(xù)活化，使傳遞到細胞內(nèi)效應器上的刺激大為延長，最終導致細胞異常增殖，發(fā)生癌變。已有報道表明肺腺癌細胞A549中存在 K－ras基因的突變［3］。研究表明早期肺腺癌中，K－ras基因突變患者的5年生存率比沒有基因突變患者的5年生存率明顯短。Suda等［4］發(fā)現(xiàn)在晚期肺腺癌患者中，K－ras基因突變患者的生存時間明顯短于無突變患者。以上資料表明:K－ras基因在肺腺癌中突變或過表達是一個大概率事件;無論是早期還是晚期肺癌患者，K－ras基因突變或過度表達，都能顯著降低病人的5年生存率。

本研究檢測了K－Ras蛋白在6例肺腺癌標本、正常毗鄰肺組織和 A549細胞中的表達，以驗證K－ras基因在肺腺癌中高表達的結(jié)論。另外，我們構(gòu)建了K－ras的反義表達載體，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染A549細胞，觀察細胞生長及凋亡情況，并檢測細胞周期相關蛋白細胞周期素A(cyclin A)、細胞周期素D1(cyclin D1)、細胞周期素E(cyclin E)、細胞周期素依賴性激酶2(cyclin－dependent kinase 2，CDK2)和細胞周期素依賴性激酶4(cyclin－dependent kinase 4，CDK4)，以及凋亡相關蛋白caspase－3、P53和Rb的表達，旨在探討K－ras反義核酸在肺癌基因治療中的作用及機制。

材料和方法

1 細胞及試劑

本研究所用的人肺腺癌細胞A549細胞株和質(zhì)粒pcDNA3.1(+)載體由本研究所保存。6例肺腺癌標本和毗鄰組織由濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院提供。RPMI－1640培養(yǎng)基、胎牛血清由HyClone提供?？笴aspase－3、P53、Rb、cyclin A、cyclin D1、K － Ras抗體由 Santa Cruz Biotechnology提供，抗 cyclin E、CDK 2和CDK4抗體由 Cell Signaling Technology提供。K－ras反義寡核苷酸引物由北京賽百盛生物科技有限公司合成。T4 DNA連接酶、EcoR I內(nèi)切酶和Hind III內(nèi)切酶均購自Fermentas，膠回收試劑盒購自大連寶生物生物技術(shù)有限公司。Lipofectamine 2000 reagent kit購自Invitrigen，Annexin V試劑盒購自碧云天生物有限公司。

2 方法

2.1 實驗分組 根據(jù)實驗要求，將A549細胞分為空白對照組(不進行任何處理)、空載體組(僅轉(zhuǎn)染了載體質(zhì)粒)和轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染了K－ras反義表達載體)。

2.2 K－ras反義表達載體的構(gòu)建 以人 K－ras基因(NM－004985)exon 1為模板，應用Primer 5.0軟件設計該基因的特異引物，序列為上游5＇－ GCGGAATTCCGGCTCGGCCAGTACTCC －3＇(下劃線為EcoR I酶切位點)，下游5＇－ GCGAAGCTTCTCTTGCCTACGCCACCA －3＇(擴展片段大小為 200 bp，下劃線為Hind III酶切位點)。應用DNA提取試劑盒(TaKaRa生物工程有限公司)，從肺腺癌細胞A549中提取基因組DNA。PCR擴增K－ras反義片段，條件為:95℃ 5 min預變性后，94℃ 45 s，62℃ 1 min，72℃ 30 s，30個循環(huán)后，72℃ 10 min。將擴增后的目的片段和pcDNA3.1(+)載體應用EcoR I和Hind III進行雙酶切，酶切體系為:K－ras片段或pcDNA3.1(+)載體10 μL、10 × buffer R 2 μL、EcoR I和Hind III各2 μL、雙蒸水 4 μL，總體系為20 μL，37 ℃孵育6 h。膠回收試劑盒回收目的片段(按照說明書進行)。T4 DNA連接酶進行連接，具體操作如下:pcDNA3.1(+)載體片段0.5 μL、K－ras目的片段1 μL、T4 DNA 連接酶 1 μL，10 × buffer 1 μL、雙蒸水6.5 μL，總體系 10 μL，22 ℃孵育 5 h。對連接產(chǎn)物進行電泳和PCR鑒定，獲得陽性克隆，并測序(北京拜爾特普生物技術(shù)有限公司完成)驗證連接的正確性［5］(命名為 antisense－ K －ras－pcDNA3.1)。

2.3 轉(zhuǎn)染 詳細操作步驟按照Lipofectamine 2000 reagent kit說明書進行操作。

2.4 MTT測細胞增殖情況 取96孔板，接種1×104個細胞，常規(guī)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染96h后，PBS洗滌細胞1次，每孔加0.1 mL PBS和10 μL MTT染液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，每孔加0.1 mL二甲基亞砜(DMSO)，在振蕩器上振蕩混勻，讓還原產(chǎn)物充分溶解。置酶聯(lián)檢測儀上測定吸光度(A)值，檢測波長570 nm。

2.5 Annexin V檢測細胞凋亡 常規(guī)培養(yǎng)細胞，轉(zhuǎn)染96 h后，PBS洗滌2次，應用binding buffer結(jié)合并懸浮細胞，加入1 μL Annexin V－FITC混勻后加入5 μL 碘化丙啶(propidium iodide，PI)進行標記，室溫避光反應5 min，應用熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況。

2.6 Western blotting檢測相關蛋白的表達 細胞總蛋白應用細胞蛋白裂解液進行提取，超聲10 s，12000 r/min離心20 min收集上清。應用Bradford試劑盒進行蛋白定量，等量的細胞總蛋白(每個泳道80 μg)應用10%的SDS－PAGE膠進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、雜交，Ⅰ抗應用兔抗 caspase－3、P53、Rb和鼠抗 cyclin A、cyclin D1、cyclin E、CDK2和 CDK4 抗體，Ⅱ抗采用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔、山羊抗鼠抗體，ECL熒光試劑盒進行曝光、顯影、定影、壓片。實驗重復3次，以目的蛋白和GAPDH吸光度比值作為目的基因的相對表達量。

3 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1 K－ras反義核酸表達載體的構(gòu)建

本研究應用PCR的方法，擴增K－ras exon 1反義片段，電泳后在200 bp顯示有一條帶，見圖1，與目的片段大小相吻合，表明 K－ras exon 1反義片段擴增正確(測序結(jié)果進行了證實)。應用EcoR I和Hind III對空白載體pcDNA3.1(+)進行雙酶切，電泳后在4000 bp顯示單一條帶，且條帶整齊，無彌散和多條帶現(xiàn)象，表明成功對pcDNA3.1(+)空白載體進行了雙酶切，見圖1。應用膠回收試劑盒對以上 K－ras exon 1反義片段和pcDNA3.1(+)雙酶切片段進行回收，電泳結(jié)果顯示在200 bp和4000 bp各有一整齊條帶，表明片段回收正確，在回收過程中無條帶斷裂等現(xiàn)象，見圖1。應用T4 DNA連接酶對以上回收的目的片段進行連接，由于電泳的方法較難區(qū)分4000 bp和4200 bp條帶，本實驗采用菌落PCR的方法對陽性克隆進行鑒定。陽性克隆菌落組電泳結(jié)果顯示在200 bp有一整齊條帶，而陰性對照PCR擴增后，電泳結(jié)果沒有任何條帶，見圖1，表明成功構(gòu)建了K－ras exon 1的反義表達載體(測序證實了該結(jié)果的正確性)。

Figure 1.The construction of antisense K－ras exon 1 expression vector.M:marker;1:the fragment of K －ras exon 1 and its length was 200 bp;2:the fragment of pcDNA3.1(+)vector digested by EcoR I and Hind III;3:the purification result of digested pcDNA3.1(+)vector;4:the purification result of digested K－ras exon 1;5:negative control that the template was the pcDNA3.1(+)vector;6:positive result that its sequence was identified.圖1 K－ras exon 1反義表達載體的構(gòu)建

2 K－Ras蛋白在肺腺癌標本和A549細胞中的表達

Western blotting檢測6例肺腺癌標本、毗鄰正常組織和A549細胞中K－Ras蛋白的表達結(jié)果顯示，與正常毗鄰組織相比較，6例標本中有4例標本K－Ras蛋白高表達，陽性率為66.7%;在A549細胞中，K－ras蛋白高表達，見圖2。

Figure 2.The expression of K－Ras in lung samples and A549 cells.A:A549 cells and lung adenocarcinoma samples(S1 －S6);B:paired adjacent normal samples.圖2 K－Ras蛋白在肺標本和A549細胞中的表達

3 反義核酸抑制K－Ras蛋白在A549細胞中的表達

轉(zhuǎn)染96 h后，各組細胞中 K－Ras蛋白的表達結(jié)果顯示antisense－K－ras－pcDNA3.1能夠明顯抑制K－ras基因的表達，抑制率可以高達70%，見圖3。

Figure 3.The expression of K －Ras in different groups.1:A549 cells;2:A549 cells transfected by pcDNA3.1;3:A549 cells transfected by antisense－ K－raspcDNA3.1.圖3 K－Ras蛋白在不同實驗組的表達

4 Annexin V檢測細胞凋亡

轉(zhuǎn)染antisense－ K－ras－pcDNA3.1的 A549細胞出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象，表現(xiàn)為發(fā)紅色熒光的細胞明顯增多，見圖4。

5 MTT測細胞生長曲線

在細胞培養(yǎng)的前3 d，細胞生長未見明顯差異。從第4 d開始，轉(zhuǎn)染antisense－ K－ras－pcDNA3.1的細胞開始出現(xiàn)明顯的生長抑制現(xiàn)象(P＜0.01)，見圖5。

Figure 4.The apoptosis among different groups(× 400).A:A549 cells;B:A549 cells transfected by pcDNA3.1(+);C:A549 cells transfected by antisense－ K －ras－pcDNA3.1.圖4 不同實驗組細胞凋亡

Figure 5.The growth curves in different groups..n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.圖5 不同實驗組細胞生長曲線

6 Western blotting檢測相關蛋白表達

與空白對照組和空載體組相比較，轉(zhuǎn)染反義K－ras的細胞中 G1/S期相關蛋白 cyclin A、cyclin D1、cyclin E、CDK2和 CDK4的表達明顯降低(均 P＜0.05)。抑癌蛋白 Rb、P53和凋亡相關蛋白caspase－3的表達明顯升高(均P＜0.01)，而空載體組和空白組，上述蛋白的表達沒有明顯差異，見圖6。

討 論

Figure 6.The expression of cyclin A，cyclin D1，cyclin E，CDK2，CDK4，Rb，P53 and caspase－3.1:control;2:pcDNA3.1(+);3:antisense－K－ras－pcDNA3.1..n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖6 各目的蛋白的表達分析

反義核酸技術(shù)是根據(jù)堿基互補原理用人工合成或生物體合成的特定DNA或RNA片段抑制或封閉基因表達的技術(shù)。根據(jù)核酸雜交原理，反義核酸可以從基因表達調(diào)控的多個層次干擾基因表達，最主要的作用靶點是在轉(zhuǎn)錄和翻譯起始階段的調(diào)控，最終抑制靶基因的表達，達到治療和預防某些疾病的目的。目前，反義核酸療法已在腫瘤學研究中廣泛應用，有些已經(jīng)進入了實驗和臨床階段，主要靶基因集中于癌基因和細胞生長因子等領域［6］。

K－ras基因是最早發(fā)現(xiàn)的癌基因之一，其編碼的蛋白質(zhì)是小G蛋白，結(jié)合GTP后被激活，水解GTP后活性喪失，是酪氨酸蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導途徑中的關鍵分子。目前，利用反義核酸技術(shù)封閉 K－ras基因表達的研究已經(jīng)滲透到癌癥研究的各個領域在肺癌、胰腺癌、甲狀腺癌、結(jié)腸癌等多個癌癥領域，都有反義K－ras抑制癌細胞生長的報道。有研究表明［7］，利用反義核酸技術(shù)，針對 K －ras基因第2、第3外顯子以及兩側(cè)2.0 kb的核酸序列，設計相應的反義核酸，轉(zhuǎn)染肺癌細胞H460后，K－ras基因表達的抑制可以高達90%以上，而且在動物實驗中，癌細胞喪失了致瘤能力。還有研究［8］利用 K－ras反義核酸封閉K－ras基因表達后，能夠明顯抑制肺癌的轉(zhuǎn)移和裸鼠致瘤能力，而且相同的結(jié)果也出現(xiàn)在胃癌細胞的研究中，但是反義 K－ras抑制腫瘤細胞生長的作用機制報道較少。

本研究6例肺腺癌標本中，有4例高表達KRas，陽性率為66.7%，而且在A549細胞中 K－Ras蛋白高表達，驗證了文獻報道中K－Ras蛋白在肺腺癌中高表達的結(jié)論，為接下來的研究奠定了基礎。接著，本研究利用反義核酸技術(shù)，針對K－ras基因exon 1，設計了反義核酸引物序列，并進行硫代化修飾，構(gòu)建了針對K－ras的反義核酸表達載體，轉(zhuǎn)染肺腺癌A549后，Western blotting檢測K－Ras蛋白的表達，從中選出了抑制作用最強的一條反義核酸;轉(zhuǎn)染A549細胞后，發(fā)現(xiàn)細胞凋亡較明顯，而且細胞生長明顯受到抑制，表明封閉 K－ras基因表達后，能夠抑制細胞的生長，促進細胞凋亡。

另外，在轉(zhuǎn)染反義 K－ras的細胞中，G1/S期相關蛋白 cyclin A、cyclin D1、cyclin E、CDK2 和 CDK4的表顯著降低，而抑癌蛋白Rb、P53以及凋亡蛋白caspase－3的表達明顯升高，表明封閉 K－ras基因表達后，促進細胞周期進行和DNA合成的相關蛋白表達降低，而抑制細胞生長、促進細胞凋亡的相關蛋白表達增加。

在細胞周期調(diào)控過程中，cyclin和CDK形成復合物調(diào)控細胞周期的進行。CyclinD1/CDK4和cyclin E/CDK2形成復合物后，促進了細胞從G1期進入S期，而cyclin A/CDK2形成復合物后，促進了S期中DNA合成的起始［9］。Rb蛋白是一個抑癌蛋白，通過抑制轉(zhuǎn)錄因子E2F的活性，使細胞停滯在G1期;p53是目前發(fā)現(xiàn)的最經(jīng)典的抑癌基因，在DNA損傷修復和促進凋亡方面發(fā)揮著重要作用。Caspase－3是促凋亡蛋白，在細胞凋亡過程中，發(fā)揮著重要作用［10］。

Cyclin D1/CDK4和cyclin E/CDK2復合物形成后，使Rb蛋白磷酸化，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，游離的E2F又可以促進其自身、cyclin D、CDK2和cyclin E等的合成，進一步促進Rb蛋白的磷酸化，釋放更多的E2F，形成一種正反饋，最終促進DNA的合成，使細胞順利通過G1/S期轉(zhuǎn)折點［11］。在這個過程中cyclin A與CDK2形成復合物促進了DNA復制的起始，啟動DNA的復制。P53蛋白通過促進G1期特異的細胞周期抑制物p21蛋白和DNA損傷修復誘導蛋白Gadd 45的表達，使DNA受損細胞不再分裂，細胞停留在 G1期［12］。

綜上所述，K－ras基因反義核酸能抑制肺腺癌A549細胞的生長，促進細胞凋亡，其機制可能與cyclin A、cyclin D1、cyclin E、CDK2、CDK4 的表達降低和caspase－3、P53、Rb的表達升高有關。

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