葉 青 趙 旭 周 玲 陸 瑩 杜文聰 李 倩 葉新華 俞曉芳 馬建華 成金羅 高燕勤

(南京醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學系，江蘇 南京 210029)

遺傳因素在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用〔1〕，其遺傳率估計為70% ～80%。脂肪組織分泌的脂聯(lián)素被證實與T2DM關系密切〔2〕。人體脂聯(lián)素水平除受到脂聯(lián)素基因多態(tài)性本身的影響，還受到有關調(diào)控基因的影響。在脂聯(lián)素編碼基因ADIPOQ的啟動子區(qū)，存在功能性過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)反應元件(PPRE)。PPAR-γ與視黃醛X受體α(RXRα)形成的異二聚體直接與PPRE 結(jié)合，激活脂聯(lián)素基因的轉(zhuǎn)錄〔3～6〕。因此，RXRα 是研究T2DM的候選基因之一。此前，本課題組已對PPAR-γ基因與T2DM遺傳易感性進行研究〔7〕，但RXRα基因多態(tài)性與T2DM易感性的關系未見國內(nèi)外報道。本研究擬探討RXRα基因遺傳變異與江蘇漢族人群T2DM遺傳易感性的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2008年3月至2010年8月，在江蘇省南京、常州及儀征地區(qū)的南京醫(yī)科大學三所附屬醫(yī)院，按照1999年WHO推薦的糖尿病診斷標準，即空腹血糖≥7.0 mmol/L或口服75 mg葡萄糖后2 h血糖(OGTT)≥11.1 mmol/L以及結(jié)合糖尿病病史，共收集門診或住院的新診斷T2DM的患者1 105例為病例組，其中男性536例，女性569例，平均年齡(57.07±11.11)歲;同時期同地區(qū)在健康體檢人群中收集正常對照(無內(nèi)分泌代謝性疾病史，無血緣關系)1 107例，男性516例，女性591例，平均年齡(57.02±11.40)歲，兩組年齡、性別頻數(shù)匹配。病例組和對照組均來自漢族人群。

1.2 調(diào)查方法 使用統(tǒng)一設計的調(diào)查表，分別對患者和健康對照進行流行病學調(diào)查，主要詢問內(nèi)容包括一般人口學特征、T2DM等慢性病病史，測量身高、體重、血壓、血糖等。上述調(diào)查和采樣均獲得被調(diào)查者同意并簽署知情同意書。調(diào)查員為本校流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學專業(yè)的研究生和內(nèi)分泌?？漆t(yī)師，經(jīng)統(tǒng)一培訓合格后，方可參加面訪調(diào)查。

1.3 方法

1.3.1 實驗室檢測 所有受試者均空腹過夜，抽取空腹靜脈血和口服75 g葡萄糖2 h后的靜脈血，用全自動生化儀測定血糖、TC(總膽固醇)、TG(甘油三酯)、HDL-C(高密度脂蛋白-膽固醇)、LDL-C(低密度脂蛋白-膽固醇)。病例組所有病人均做GAD(谷氨酸脫羧酶抗體)、ICA512(胰島細胞抗體)(英國RSI公司試劑盒)檢測，以排除1型糖尿病;用PCR/Apal酶切法做線粒體基因突變〔(Trnal EU(UUR)3243A＞G)〕檢測，以排除線粒體基因突變型糖尿病。低溫(－30℃)保存血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清脂聯(lián)素指標。檢測試劑盒購自RapidBio公司，酶標儀型號BIO-RAD Model680型。

1.3.2 基因位點的檢測

1.3.2.1 RXRα基因位點的選擇 采用選擇潛在功能性單核苷酸(SNPs)位點的策略:以RXRα基因為研究的目的基因，從NCBI、HAPMAP等數(shù)據(jù)庫以及已發(fā)表的文獻中尋找和確認各基因的SNPs位點，選擇在中國人群具有較高頻率(MAF≥5%)并且可能影響基因功能的SNPs位點為研究靶點。確定了RXRα基因的4個 SNPs位點:rs1045570，rs4842194，rs3132291，rs4240711。探討其與T2DM的易感性關系。

1.3.2.2 基因型檢測 抽取研究對象外周血5 ml，采用酚-氯仿提取、乙醇沉淀的方法提取白細胞中的基因組DNA，并作為PCR模板。利用Real-time PCR聯(lián)合 Taqman-MGB探針對RXRα基因的位點進行基因分型。按下列體系加樣(5 μl體系):0.5 μl DNA 模板，2.5 μl TaqMan?Universal PCR Master Mix，0.25 μl順式/反式引物，0.125 μl探針，1.25 μl ddH2O。反應條件:2 min 50℃、10 min 95℃，15 s 95℃，1 min 60℃，40 個循環(huán)?；驍U增的引物和探針序列見表1，利用SDS 2.0軟件(ABI)觀察結(jié)果。每塊384孔板包括2個來自同一樣本的陽性對照和2個空白樣本的陰性對照。本研究中共檢測2 212份DNA樣本，成功率為100%，抽取其中10%樣本重復檢測，一致性100%。

表1 RXRα基因SNP位點基因擴增的引物和探針序列

1.4 統(tǒng)計學分析 采用EPIDATA3.1軟件，兩人雙軌錄入全部數(shù)據(jù)資料，核對無誤后供分析使用。采用統(tǒng)計軟件SPSS13.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析:χ2檢驗 、student-t檢驗用于分析人口學的基本特征、T2DM相關生物學指標及RXRα基因4個位點的等位基因頻率在病例組和對照組的分布差異;Logistic回歸分析計算OR值及95%CI;擬合優(yōu)度χ2檢驗用于對照組基因型分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗;采用LDA〔8〕軟件(Linkage Disequilibrium Analyzer 1.0)分析基因連鎖不平衡;運用PHASE 2.0軟件根據(jù)觀察到的基因型推斷單倍型及其頻率。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗 在對照組中，對RXRα基因的 4 個 SNPs位點 (rs1045570，rs4842194，rs3132291，rs4240711)三種基因型的頻率進行遺傳平衡檢驗，結(jié)果顯示實際頻數(shù)與理論頻數(shù)分布的差別均無統(tǒng)計學意義(P=0.458，0.471，0.389，0.703)，說明該對照組人群4個位點基因型頻率分布均符合遺傳平衡法則，具有人群代表性。

2.2 兩組基本資料比較 病例組平均收縮壓、舒張壓、TG、TC、空腹血糖和脂聯(lián)素水平顯著高于對照組(P＜0.05);HDL-C顯著低于對照組(P＜0.05)。兩組的性別構(gòu)成、平均年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)和LDL-C水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表2。

2.3 單倍型分析 采用LDA軟件，對上述4個位點SNPs的連鎖不平衡分析顯示，4個多態(tài)性位點處于低連鎖不平衡(D'值0.1～0.8)。RXRα基因4個潛在功能性位點(順序依次為rs1045570，rs3132291，rs4240711，rs4842194)構(gòu)成的 4 種主要單倍型中，與最常見的單倍型GTAT相比，單倍型TTAT(含變異等位基因rs1045570T)可顯著降低T2DM的患病風險〔調(diào)整OR(95%CI)=0.868(0.801～0.940)〕。見表3。

表2 兩組基本資料比較(±s)

表2 兩組基本資料比較(±s)

變量 病例組(n=1 105) 對照組(n=1 107) P值男/女(n)536/569 516/591 0.372年齡(歲) 57.07±11.11 57.02±11.40 0.380收縮壓(mmHg) 137.99±20.56 127.93±18.13 ＜0.001舒張壓(mmHg) 85.02±11.80 79.35±10.42 0.002 BMI(kg/m2) 24.88±3.55 24.15±3.27 0.069 HDL-C(mmol/L) 1.14±0.46 1.42±0.37 0.017 LDL-C(mmol/L) 2.82±0.96 2.57±0.89 0.062 TC(mmol/L) 5.16±1.37 5.04±0.95 ＜0.001 TG(mmol/L) 2.62±2.75 1.60±1.04 ＜0.001空腹血糖(mmol/L) 10.91±3.94 5.08±0.53 ＜0.001脂聯(lián)素(mg/L)6.23±1.74 7.14±2.62 ＜0.001

表3 RXRα基因潛在功能性SNPs單倍型與T2DM易感性的關系

2.4 RXRα基因在病例組和對照組的基因型分布及其比較RXRα基因4個位點基因型和等位基因頻率在兩組間的分布無顯著差異(均P＞0.05)。在調(diào)整性別、年齡和BMI等因素后，仍未發(fā)現(xiàn)4個位點與T2DM易感性存在統(tǒng)計學關聯(lián)。見表4。

表4 RXRα基因多態(tài)性與T2DM易感性分析〔n(%)〕

3 討論

RXRα是甲狀腺/類固醇受體家族中的一種普通DNA結(jié)合受體。RXRα可被內(nèi)源性激動劑9-順式視磺酸激活，同樣能激活 PPAR:RXR 復合物〔9〕。Metzger〔10〕等通過動物實驗發(fā)現(xiàn)RXRα基因的表達在脂肪生成及肥大過程中起重要作用。此外，Wan〔11〕等研究發(fā)現(xiàn)缺乏肝臟RXRα的小鼠攝食量減少，增加體重以及改善糖耐受。Imai〔12〕和 Yang〔13〕都發(fā)現(xiàn) RXRα 在肝細胞的增殖和生長過程中起重要作用。因此，有必要進行人群RXRα基因多態(tài)性與T2DM易感性的關聯(lián)研究。本課題組采用病例對照研究，探討中國南方漢族人群RXRα基因標簽位點(另已報道)〔7〕和潛在功能性位點SNPs多態(tài)性與T2DM的關聯(lián)性。本文4個潛在功能性位點等位基因頻率與NCBI中中國人群的數(shù)據(jù)均相接近。經(jīng)多因素回歸分析調(diào)整年齡、性別及BMI后，4個位點均未發(fā)現(xiàn)與T2DM易感性存在統(tǒng)計學關聯(lián)。

由RXRα基因的4個潛在功能性位點構(gòu)成的單倍型分析中，發(fā)現(xiàn)單倍型TTAT(含變異等位基因 rs1045570T)較最常見的單倍型GTAT可顯著降低T2DM的患病風險。推測變異等位基因rs1045570 T可能需要其他多態(tài)位點協(xié)同而發(fā)揮作用，存在位點-位點間的交互作用。本文樣本人群中攜帶危險單倍型GTAT者達到50%以上，從這個角度而言，這些單倍型攜帶者是T2DM高危人群，更要避免和減少暴露肥胖等環(huán)境危險因素，應該強調(diào)通過科學的生活方式，包括合理膳食及堅持體育鍛煉等，控制體重在正常水平，以預防和延緩T2DM的發(fā)生。值得指出的是本研究的階段性資料(病例520例，對照550例)中，由于病例和對照組TTAT單倍型頻率均很低，因此未顯示該單倍型在兩組的頻率分布顯著差異。同時，其他單倍型或有與本文相反結(jié)果。本文通過大樣本的病例對照研究，一方面可以減少樣本含量偏小可能造成的假陽性或假陰性錯誤，另一方面可以發(fā)現(xiàn)與T2DM易感性相關的突變頻率相對較低的RXRα基因單核苷酸遺傳變異位點，從而更客觀地評價RXRα基因多態(tài)性在T2DM發(fā)生發(fā)展中的作用。

鑒于病例對照研究設計很難避免樣本人群的偏倚問題，本文有關TTAT單倍型可降低T2DM發(fā)病風險的發(fā)現(xiàn)，有必要在其他人群中進一步驗證，并進而通過功能實驗得以確定。

1 O'Rahilly S，Barroso I，Wareham NJ.Genetic factors in type 2 diabetes:the end of the beginning〔J〕?Science，2005;307:370-3.

2 Gil-Campos M，Canete R，Gil A.Adiponectin，the missing link in insulin resistance and obesity〔J〕.Clin Nutr，2004;23:963-74.

3 Iwaki M，Matsuda M，Maeda N，et al.Induction of adiponectin，a fat-derived antidiabetic and antiatherogenic factor，by nuclear receptors〔J〕.Diabetes，2003;52:1655-63.

4 Neumeier M，Weigert J，Schaffler A，et al.Regulation of adiponectin re-ceptor 1 in human hepatocytes by agonists of nuclear receptors〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2005;334(3):924-9.

5 Yamamoto Y，Hirose H，Miyashita K，et al.PPAR(gamma)2 gene Pro12Ala polymorphism may influence serum level of an adipocyte-derived protein，adiponectin，in the Japanese population〔J〕.Metabolism，2002;51:1407-9.

6 Thamer C，Machicao F，F(xiàn)ritsche A，et al.No influence of the PPARgamma2 Pro12Ala genotype on serum adiponectin concentrations in healthy Europeans〔J〕.Metabolism，2003;52:798-9.

7 Juan Du，Hui Shi，Ying Lu，et al.Tagging single nucleotide polymorphisms in peroxisome proliferators activated receptor-γ (PPAR-γ)and retinoid X receptor-α (RXR-α)gene and type 2 diabetes risk:a case-control study of a Chinese Han population〔J〕.J Biom Res，2011;25(1):33-41.

8 Keyue D，Kaxin Z，F(xiàn)uchu HE，et al.LDA-a java-based linkage disequilibrium analyzer〔J〕.Bioinformatics，2003;19:2147-8.

9 Ray DM，Spinelli SL，O'Brien JJ，et al.Platelets as a novel target for PPAR gamma ligands:implications for inflammation，diabetes，and cardiovascular disease〔J〕.BioDrugs，2006;20(4):231-41.

10 Metzger D，Imai T，Jiang M，et al.Functional role of RXRs and PPAR gamma in mature adipocytes〔J〕.Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids，2005;73:51-8.

11 WanYJ，Han G，Cai Y，et al.Hepatocyte retinoid X receptor-alpha-deficient mice have reduced food intake，increased body weight，and improved glucose tolerance〔J〕.Endocrinology，2003;144(2):605-11.

12 Imai T，Jiang M，Kastner P，et al.Selective ablation of retinoid X receptor alpha in hepatocytes impairs their lifespan and regenerative capacity〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2001;98:4581-6.

13 Yang X，Guo ML，Yu-Jui Yvonne Wan.Deregulation of growth factor，circadian clock，and cell cycle signaling in regenerating hepatocyte RXRalpha-deficient mouse livers〔J〕.Am J Pathol，2010;176:733-43.