宋 宇，劉繼平，石富國，蘭 洲，厲璐帆，馬世平

中國藥科大學(xué)中藥藥理教研室

各種腦血管病變引起的中樞缺血性疾病是現(xiàn)代社會危害中老年人健康的重要疾病，具有發(fā)病率高、致殘率高和死亡率高的特點(diǎn)。因此探索腦缺血的病理機(jī)制及尋找有效的治療藥物具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值和社會意義。星形膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫吞噬細(xì)胞，在腦缺血及缺血再灌注后，被各種致炎因素激活成反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞。激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放多種炎性介質(zhì)，如白介素-1β（interleukine-1β，IL-1β）、白介素-6（interleukine-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、一氧化氮（nitric oxide，NO）及前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）等[1]。 這些炎癥介質(zhì)可以進(jìn)一步激活周圍的膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致突觸消失，神經(jīng)元凋亡或壞死，形成二次損傷[2]。因此抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞過度的激活和炎性介質(zhì)的大量釋放有助于保護(hù)神經(jīng)元，在腦缺血治療中具有重要意義。

鉤藤是茜草科植物鉤藤（Uncaria rhynchophylla Jacks)及其同屬植物的帶鉤莖枝,有清熱平肝、息風(fēng)定驚的功效，臨床用于治療癲癇、驚厥和高血壓等病[3]。目前已從鉤藤中分離出30多種化合物，異鉤藤堿(isorhynchophylline，IRN，圖 1)是其中的一種具有多種藥理活性的成分，早期的研究主要集中于異鉤藤堿的降壓、抗心律失常作用[4-5]。近年來，鉤藤提取物和異鉤藤堿都顯示出抗中樞缺血再灌注損傷作用，很多研究指出，異鉤藤堿可以降低興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡和損傷。進(jìn)一步研究還表明，異鉤藤堿可以抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和炎性因子的釋放[6]。然而異鉤藤堿對于激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用目前還不清楚。

本實(shí)驗(yàn)用LPS刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞模擬腦內(nèi)炎性環(huán)境，觀察不同濃度的異鉤藤堿對IL-1β和TNF-α釋放的抑制作用，以及異鉤藤堿對iNOS mRNA表達(dá)水平的影響，初步探索異鉤藤堿發(fā)揮抗炎作用的分子機(jī)制。

圖1 異鉤藤堿的結(jié)構(gòu)式

1 材 料

1.1 試劑

異鉤藤堿（廣西中醫(yī)藥研究所，純度:97.8%）；DMEM 培養(yǎng)基干粉（Gibco，批號:31800-014）；小牛血清(Gibco，批號:16010-159)；注射用青霉素鈉、注射用硫酸鏈霉素 (山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司)；胰蛋白酶（1:250）（Typsin，南京大治生物技術(shù)有限公司）；一抗:大鼠抗人膠質(zhì)纖維酸性蛋白單克隆抗體(GFAP，武漢博士德生物工程有限公司)；一氧化氮測試試劑盒 （南京建成生物工程研究所）；IL-1β和TNF-α 的 ELISA 試劑盒（Santa Cruz）。

1.2 儀器

CO2培養(yǎng)箱 （TEHER）、倒置顯微鏡 （PM-6 Olympus）；Mini-REPOTEAN 電 泳槽 （Bio-Red 公司）；TGL-16G高速冷凍離心機(jī) （日本日立公司）；DYY-Ⅲ型電轉(zhuǎn)移槽（北京六一儀器廠）；Biocell2010酶標(biāo)儀（Anthos Labtec Instruments公司）。

1.3 動(dòng)物

新生1天的Sprague Dawley大鼠 （上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），許可證號:SCXZ（滬）2008-0016。

2 方法與結(jié)果

2.1 新生大鼠腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與純度鑒定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[7],在無菌條件下取新生SD鼠大腦皮質(zhì)，去除血污，仔細(xì)剝除腦膜和血管，然后將其剪碎成小塊（＜1 mm3），加入0.125%的胰酶消化15 min，并輕輕吹打制成單細(xì)胞懸液。移入離心管，加入適量的含20%血清的DMEM培養(yǎng)基中止消化。200目篩網(wǎng)過濾，1000 r·min-1離心 8 min，吸棄上層，然后加入適量含20%血清的DMEM培養(yǎng)基，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至 2×105·mL-1，并將其接種至玻璃培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min；翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶吸出瓶中的細(xì)胞懸液，放入另一個(gè)培養(yǎng)瓶內(nèi)，同法，再差速貼壁一次，將濾液接種至塑料培養(yǎng)瓶中，接種密度約1×105·mL-1。次日換液，去除未貼壁的活力差及死亡細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)9～12d，培養(yǎng)液顏色略變黃時(shí)換液，每次換液稍加振搖,12d開始每4d傳一代，共傳三次，每次傳代均差速貼壁0.5h。

將傳至4代的星形膠質(zhì)細(xì)胞按照1×105·mL-1接種至多聚賴氨酸包被的蓋玻片上，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3d后,取出蓋玻片，進(jìn)行GFAP免疫組化鑒定，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)所使用星形膠質(zhì)細(xì)胞純度＞95%。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組、藥物處理及數(shù)據(jù)分析

待細(xì)胞長至80%融合度時(shí)，以1×105密度接種于96孔板或6孔板。細(xì)胞培養(yǎng)48h后，吸去原培養(yǎng)液，用無糖Earle’s液清洗1遍，同時(shí)加入含有LPS或含有LPS與異鉤藤堿的無糖培養(yǎng)基進(jìn)行處理，細(xì)胞處理后分為空白組；LPS（1μg·mL-1）處理模型組；LPS+IRN 3μg·mL-1組；LPS+IRN 10μg·mL-1組；LPS+IRN 30μg·mL-1組。 孵育 24 h。 吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清液并收集細(xì)胞，用于實(shí)驗(yàn)檢測。

2.3 IRN對細(xì)胞活力的影響

將分組培養(yǎng)處理后的96孔板，加入20μL的MTT(5 g·L-1)37℃繼續(xù)孵育 4 h，棄去上清液，每孔加入150μL二甲亞砜，振蕩10 min，以波長520 nm于酶標(biāo)儀上測吸光度值。以空白對照組吸光度值均數(shù)為100%，計(jì)算細(xì)胞存活率。各孔細(xì)胞存活率(%)=（各組吸光度值/空白組吸光度值均數(shù)）×100%。

如表1所示，與空白對照組相比，LPS刺激并未明顯的改變星形膠質(zhì)細(xì)胞的活力，異鉤藤堿不同濃度單獨(dú)處理或與LPS共同孵育都未能明顯的改變星形膠質(zhì)細(xì)胞的活力。

表1 IRN對星形膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響（，n＝6）

表1 IRN對星形膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響（，n＝6）

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO含量的測定

藥物處理后，收集細(xì)胞上清液，1500 r·min-1，4℃離心10 min。根據(jù)Griess法測定培養(yǎng)液中NO的含量[8]。具體測定方法按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

與空白對照組相比，LPS刺激顯著地升高了星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中NO的含量，如表2所示，IRN可以劑量依賴地降低培養(yǎng)基中NO的水平，與LPS組相比，IRN 30μg·mL-1孵育可以顯著地降低星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎性介質(zhì)NO釋放。

表2 IRN對LPS誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞NO釋放的抑制作用（，n＝6）

表2 IRN對LPS誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞NO釋放的抑制作用（，n＝6）

注:##p＜0.01 vs空白組，*p＜0.05 vs LPS 組

2.5 PCR檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞中iNOS mRNA的含量

藥物處理后，用PBS洗滌細(xì)胞，按Trizol試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA。然后采用隨機(jī)引物,參照逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV說明書方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR。引物核苷酸序列分別為iNOS引物序列:sense，5’-AGAGAGATCCGGTTCACA-3’；antisense，5’-CAC AGA ACT GAG GGT ACA-3’(GenBank accession number S71597)。 GADPH 引物序列 sense，5’-GAAGGG TGGGGCCAAAAG-3’； antisense， 5’-GGATGCAGGGAT GATGTTCT-3’ (Gen Bankaccession number AB017801)。將PCR產(chǎn)物電泳，用紫外凝膠成像系統(tǒng)照相，并用Kodak Digital Science 1D分析軟件進(jìn)行灰度掃描和分析。

如圖2與表3所示，RT-PCR結(jié)果表明空白組基本觀察不到iNOS mRNA表達(dá)，而LPS刺激顯著地誘導(dǎo)了iNOS mRNA的表達(dá)。不同濃度的IRN處理呈劑量依賴性的抑制了LPS誘導(dǎo)的iNOS mRNA表達(dá)。

圖2 IRN對iNOS mRNA表達(dá)水平的影響

表3 IRN 抑制 iNOS mRNA 表達(dá)水平（，n＝6）

表3 IRN 抑制 iNOS mRNA 表達(dá)水平（，n＝6）

##p＜0.01 vs空白組；**p＜0.01,*p＜0.05 vs LPS 組

2.6 ELISA法測定細(xì)胞上清液中的IL-1β和TNF-α含量

藥物處理24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。分別按ELISA試劑盒說明書繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和測定培養(yǎng)上清液中的IL-1β和TNF-α含量水平。

結(jié)果如表4所示，LPS組IL-1β和TNF-α的水平都遠(yuǎn)高于空白對照組，而IRN不同濃度組都明顯的降低了這兩種炎性因子的含量。

表4 IRN 對 IL-1β 和 TNF-α 釋放含量的影響（，n＝6）

表4 IRN 對 IL-1β 和 TNF-α 釋放含量的影響（，n＝6）

##p＜0.01 vs空白組,*p＜0.05 vs LPS組

3 討 論

大量研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血疾病中扮演著重要角色，在缺血及再灌注后，缺血灶周圍大量的星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活，激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞一方面分泌出神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 （brain-derived neurotrophic factor，BDNF）和膠質(zhì)源性神經(jīng)生長因子（glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF）， 促進(jìn)受損的神經(jīng)元的修復(fù)與再生[8]。另一方面，激活的膠質(zhì)細(xì)胞在缺血再灌注的初期不但參與抗原遞承，啟動(dòng)炎性過程，還分泌了大量的炎性介質(zhì)，例如NO、PGE2、IL-1β和 TNF-α等， 這些炎性介質(zhì)進(jìn)一步激活了周圍的膠質(zhì)細(xì)胞，加重了腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)，形成缺血后的二次損傷[2]。

NO對細(xì)胞的作用具有兩面性，中樞神經(jīng)系統(tǒng)在一氧化氮合酶(NOS)作用下通過左旋精氨酸-NO途徑產(chǎn)生NO。NOS同工酶有3種亞型，即神經(jīng)型(nNOS)、內(nèi)皮型(eNOS)以及誘導(dǎo)型(iNOS)。生理狀態(tài)下，由eNOS和nNOS產(chǎn)生的少量NO可滅活氧自由基，并調(diào)節(jié)腦血流。在腦缺血再灌注過程中，腦內(nèi)產(chǎn)生的多種炎性介質(zhì)均可激活星形膠質(zhì)細(xì)胞iNOS，釋放大量的NO，導(dǎo)致神經(jīng)元去極化和谷氨酸鹽釋放增加，繼而產(chǎn)生神經(jīng)興奮性中毒，造成神經(jīng)元損傷或誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡[9]。異鉤藤堿可以有效地降低LPS激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞中iNOS mRNA的表達(dá)，從而明顯地減少了NO的合成和釋放，降低缺血再灌注后的二次損傷。IL-1β和TNF-α具有更廣泛的生理病理作用，IL-1β是觸發(fā)免疫和炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，誘導(dǎo)細(xì)胞粘附分子表達(dá)，吸引中性粒細(xì)胞聚集，激活膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的基因表達(dá)及分泌，促進(jìn)神經(jīng)毒性物質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，IL-1β可誘導(dǎo)及加快凋亡基因表達(dá)[10]。TNF-α可以刺激膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生多種炎癥因子，并調(diào)控多種細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞功能；直接或間接的引起神經(jīng)元損傷或死亡[11]。異鉤藤堿對LPS刺激的星形膠質(zhì)細(xì)胞的IL-1β和TNF-α分泌顯示出強(qiáng)大的抑制作用，有效地減輕了缺血后膠質(zhì)細(xì)胞激活介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的進(jìn)一步加重，從而有利于神經(jīng)元的存活和再生。

本研究表明，異鉤藤堿可以顯著地抑制LPS刺激的星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性介質(zhì)NO的釋放，降低iNOS mRNA的表達(dá)水平，同時(shí)減少致炎因子IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生。已有研究證明，異鉤藤堿還能有效地抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和炎性因子的釋放。這些結(jié)果說明異鉤藤堿具有較好地抑制中樞炎癥反應(yīng)的作用，為傳統(tǒng)中藥鉤藤作為治療缺血性腦病藥物提供了科學(xué)依據(jù)。

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