柴寶娟，李 祥，陳建偉

南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 210046

大黃為臨床常用中藥，近年來有文獻(xiàn)報(bào)道大黃蒽醌類成分主要對腎臟有毒性，對肝臟毒性較小[1-3]。大黃臨床上常經(jīng)過配伍或炮制后給藥，本課題組為考察大黃配伍之后能否降低大黃肝腎毒性，預(yù)先考察大黃產(chǎn)生明顯肝腎毒性的毒性劑量，從而設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)，觀察大黃總提物對大鼠亞急性毒性影響。為充分暴露大黃的整體毒性，本實(shí)驗(yàn)采用醇提與水提相結(jié)合的方式，制備大黃總提物，考察不同劑量下給予大黃總提物一個(gè)月后對大鼠肝腎的影響，從而為后期大黃配伍減毒時(shí)的大黃藥理劑量打下基礎(chǔ)，并為大黃臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大黃購于安徽豐原銅陵中藥飲片有限公司，經(jīng)本文作者陳建偉鑒定為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L.的干燥根及根莖。

大黃總提物的制備方法:將大黃粉碎得粗粉，加10倍95%乙醇加熱回流3次，每次1h，合并濾液濃縮得醇提液，濾渣揮去乙醇，加10倍量水，加熱提取1h，濾液與醇提液合并，減壓干燥得總提物。大黃總提物為棕色粉末，得率為49.1%。以0.5%羧甲基纖維素鈉(CMCNa)將其研磨配成相應(yīng)濃度的混懸液供試驗(yàn)用。

1.2 試驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)采用上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供的清潔級SD大鼠40只，雌雄各半，體重180～220 g，合格證號:SCXK(滬)2007-0005。

1.3 儀器

Dimension Xpand全自動生化儀 （美國杜邦公司）；ADVIA 120全自動血液分析儀 （Bayer公司）；臺式離心機(jī)TGL-16B（上海安亭科學(xué)儀器廠）等。

1.4 試驗(yàn)方法

經(jīng)環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將動物隨機(jī)分為4組，每組大鼠雌雄各5只。試驗(yàn)按2010版《中華人民共和國藥典》規(guī)定人用大黃最高劑量（0.25g·kg-1·d-1）[4]的等效量的2倍、4倍、8倍設(shè)3個(gè)劑量組（人等效量參考文獻(xiàn)[5]），分別為 3.0、6.0、12.0 g·kg-1·d-1（生藥），同時(shí)設(shè)正常對照組。大鼠按每100g體重灌胃給藥2 mL受試藥混懸液，每天1次，連續(xù)給藥30天。正常對照組給予同體積的0.5%CMC-Na溶液。試驗(yàn)動物每周稱體重1次，根據(jù)體重變化調(diào)整給藥量。實(shí)驗(yàn)期間動物自由進(jìn)食飲水，每天觀察動物的一般狀況。末次給藥禁食不禁水24 h后，眼眶靜脈取血作血常規(guī)及生化指標(biāo)測定，動物取血后處死，取出脾臟、胸腺、肝、腎組織進(jìn)行觀察和稱重。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 一般檢查 每天觀察動物的一般狀況:精神狀態(tài)、反應(yīng)、行為活動、排便情況、毛色、清潔度等。

1.5.2 血液學(xué)檢查 末次給藥禁食不禁水24 h后，眼眶取血1 mL，加入肝素鈉抗凝，測定下列指標(biāo):紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白含量(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)；白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、淋巴細(xì)胞相對計(jì)數(shù)(LY)、中性粒細(xì)胞相對計(jì)數(shù)(NE)、單核細(xì)胞相對計(jì)數(shù)(Mon)。

1.5.3 血液生化指標(biāo)檢查 末次給藥禁食不禁水24 h后，眼眶取血4 mL，離心分離血清，用全自動生化儀測定天門冬酸轉(zhuǎn)氨酶 (AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Crea)。

1.5.4 病理檢查 大鼠解剖觀察，對各臟器進(jìn)行肉眼觀察，將脾臟、胸腺取出稱重，計(jì)算臟器指數(shù)（臟器重量/體重）；取肝、腎組織，用10%中性甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，鏡檢。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 一般形態(tài)觀察

給藥組大鼠在給藥后即排軟便，糞便顏色呈棕褐色，尿液顏色呈微黃。中、高劑量組在給藥2周后大鼠活動差，進(jìn)食少，尿液呈深黃色，排稀便，糞便顏色灰黃色，皮毛豎立無光澤，污穢；低劑量組給藥3周后皮毛清潔度較差，活動減少，精神不佳，尿液呈黃色，軟便，糞便顏色呈棕黃色。

高劑量對大鼠體重增長有抑制作用，給藥30天后雄性大鼠體重與對照組相比有差異，給藥1周后低劑量組雌性大鼠體重與對照組相比有顯著差異 （P＜0.05），1 周后體重增長與對照組無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 大黃總提物對大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

結(jié)果見表1。給藥30天后高劑量組動物的Mon升高，各劑量組其余所檢指標(biāo)與對照組相比均無顯著差異(P＞0.05)。

2.3 大黃總提物對大鼠血液生化指標(biāo)的影響

結(jié)果見表2。給藥30天后高劑量組AST、ALT均顯著高于對照組 （P＜0.01），Crea與對照組相比略有降低 （P＜0.05），BUN與對照組相比無差異；中、低劑量組與對照組相比，各指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 大黃總提物給藥30天對大鼠血液細(xì)胞學(xué)指標(biāo)的影響（，n=10）

表1 大黃總提物給藥30天對大鼠血液細(xì)胞學(xué)指標(biāo)的影響（，n=10）

注:與對照組比較:*P＜0.05，**P＜0.01

表2 大黃總提物給藥30天對大鼠血液生化指標(biāo)的影響（，n=10）

表2 大黃總提物給藥30天對大鼠血液生化指標(biāo)的影響（，n=10）

注:與對照組比較:*P＜0.05，**P＜0.01

2.4 大黃總提物對臟器指數(shù)的影響及病理組織學(xué)檢查狀況

給藥30天后，脾臟、胸腺的臟器系數(shù)與對照組比較無顯著性差異。組織學(xué)檢查表明，給藥30天后，高劑量組出現(xiàn)2例肝臟彌漫性肝細(xì)胞重度水腫，胞漿疏松淡染，1例肝臟輕度水腫；中劑量組出現(xiàn)1例肝臟彌漫性肝細(xì)胞輕度水腫；低劑量組未見肝臟病變。各組腎臟和對照組相比未見明顯的病理改變。結(jié)果見圖1。物質(zhì)基礎(chǔ)還有待研究。

3 討 論

目前認(rèn)為大黃的毒性成分為蒽醌類成分，本課題組前期研究[6]表明，大黃配伍后總蒽醌與結(jié)合蒽醌的量均有不同程度的降低，游離蒽醌降低較少，提示大黃配伍后可能會降低肝腎毒性，具體的減毒

圖1 大鼠肝組織病理切片圖(HE×200)

實(shí)驗(yàn)中在測定大黃對血液細(xì)胞學(xué)指標(biāo)的影響時(shí)，中劑量組有4個(gè)樣本出現(xiàn)不同程度的血塊，從而造成結(jié)果低于對照組，可能是由于取血時(shí)采用的肝素抗凝效果不佳，取血過程中造成污染引起的。此外，本實(shí)驗(yàn)中高中低劑量普遍不呈現(xiàn)劑量關(guān)系，可能由于設(shè)定的組間差距不夠大以及動物間個(gè)體差異引起。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明大黃低劑量（3 g·kg-1）連續(xù)給藥30d，對大鼠的肝腎不會產(chǎn)生毒性作用，當(dāng)劑量達(dá)到12 g·kg-1時(shí)，大鼠 ALT、AST顯著性升高，病理顯示肝臟出現(xiàn)彌漫性水腫，對大鼠的肝臟毒性作用較明顯。各劑量組腎臟未顯示病理病變。張陸勇[7]等對SD大鼠行大黃總蒽醌灌胃13周后，高劑量組即出現(xiàn)腎臟近曲小管上皮細(xì)胞不同程度腫脹變性。推測本實(shí)驗(yàn)未檢測出腎臟毒性，可能是由于實(shí)驗(yàn)周期不夠長。王伽伯等[8]觀察大黃不同炮制品對小鼠肝腎毒性的影響，發(fā)現(xiàn)生大黃最大給藥量（76 g·kg-1·d-1）給小鼠連續(xù)灌胃14天，出現(xiàn)肝腎損傷，炮制品毒性較小。本實(shí)驗(yàn)未出現(xiàn)腎毒性，也可能由于大黃劑量不足引起。

當(dāng)大黃劑量達(dá)到 6 g·kg-1·d-1（相當(dāng)于人最高等效劑量的4倍）時(shí)，即對大鼠產(chǎn)生肝毒性，高劑量時(shí)測定Crea與對照組相比降低，可能是由于大鼠給予高劑量大黃后活動明顯減少，肌肉代謝降低，產(chǎn)生的肌酐量降低引起。本實(shí)驗(yàn)提示，臨床大黃的最大使用量應(yīng)不超過30 g·d-1，服藥周期不超過一個(gè)月。

[1]王青秀，廖明陽，吳純啟.大黃及其主要成分的毒性毒理研究[J]. 毒理學(xué)雜志，2007，21(4):301.

[2]笪紅遠(yuǎn)，江振洲，王翠芬，等.大黃酸和大黃素在體外對人腎小管上皮細(xì)胞的毒性作用研究[J].中草藥，2009，40(1):102-5.

[3]雷 湘，陳 剛，陳科力，等.大黃素對小鼠的急性毒性研究[J]. 中藥藥理與臨床，2008，24(1):29.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:23.

[5]黃繼漢，黃曉暉，陳志揚(yáng)，等.藥理試驗(yàn)中動物間和動物與人體間的等效劑量換算 [J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2004，9(9):1069-72.

[6]秦 云，李 祥，陳建偉，等.大黃中蒽醌類成分配伍前后的量變規(guī)律[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(5):94-8.

[7]張陸勇，江振洲，濮存海，等.大黃總蒽醌對SD大鼠灌胃給藥的長期毒性研究[J].中國生化藥物雜志，2004，25(4):206-9.

[8]王伽伯，馬永剛，張 萍，等.炮制對大黃化學(xué)成分和肝腎毒性的影響及其典型相關(guān)分析[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2009，44(8):885-90.