劉 淵 卞兆連 韓小鳳 王綺夏 邱德凱 馬 雄

上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院消化內科 上海市消化疾病研究所（200001）

自身免疫性肝炎（AIH）是由異常自身免疫反應介導的肝實質炎癥性病變，以高丙種球蛋白血癥、血清自身抗體陽性和對免疫抑制治療有應答為特點[1,2]，其病因和發(fā)病機制目前尚不清楚。大量研究發(fā)現(xiàn)AIH患者肝臟內有大量激活的淋巴細胞浸潤，并分泌高水平促炎細胞因子，這些淋巴細胞和炎癥介質在肝臟炎癥損傷過程中起重要作用[3]。α-半乳糖神經(jīng)酰胺（α-GalCer）為不變型Vα14自然殺傷T細胞（NKT細胞）的特異性配體，可誘導免疫介導的肝損傷小鼠模型，模型小鼠血清轉氨酶水平升高，肝小葉內大量炎性細胞浸潤，肝細胞變性壞死，其特點與人類AIH極為相似。研究[4]發(fā)現(xiàn)予C57BL/6小鼠注射α-GalCer可誘導明顯的細胞因子反應，包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）、白細胞介素-2（IL-2）、IL-4、IL-6 等。

肝臟X受體（LXR）屬于核受體超家族成員，對脂類代謝相關基因的轉錄調控起關鍵作用。近年研究發(fā)現(xiàn)LXR還具有調節(jié)免疫反應和抗炎效應。在接觸性皮炎、動脈粥樣硬化、自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型中，LXR激動劑可有效抗炎、抑制炎癥基因表達，調節(jié)免疫反應[5 ～ 7]。本研究通過觀察LXR激動劑對α-GalCer誘導的小鼠肝損傷的影響，探討LXR激活對肝損傷的保護作用及其可能機制，為進一步了解AIH的發(fā)病機制、探索AIH的潛在治療靶點提供實驗依據(jù)。

材料與方法

一、實驗動物和主要試劑

雄性清潔級C57BL/6J小鼠15只，6 ～ 8周齡，體質量18 ～ 22 g，由中科院上海實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于上海交通大學醫(yī)學院實驗動物科學部實驗動物飼養(yǎng)中心。標準商業(yè)飼料購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。

LXR激動劑T0901317（Cayman Chemical Company），α-GalCer Analog 7（AXXORA?Platform），即用型免疫組化超敏UltraSensitiveTMSP試劑盒（福州邁新生物技術開發(fā)公司），羊抗鼠IL-6多克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology,Inc.），蛋白抽提試劑盒（碧云天生物技術研究所），小鼠 Akt、p-Akt、IκBα、p-IκBα、PI3K （p85）、NF-κB （p65）抗 體 （Cell Signaling Technology,Inc.），TRIzol?試劑（InvitrogenTMby Life Technologies），PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）、SYBR?Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）（TaKaRa Bio Inc.）。

二、方法

1.動物分組和模型制備：小鼠隨機分為3組，分別為正常對照組、α-GalCer模型組和LXR治療組，每組5只。

T0901317預先溶于DMSO，濃度為50 mg/ml，－20℃保存，使用前以0.9%NaCl溶液稀釋至3 mg/ml[8]。 α-GalCer預先溶于 DMSO，濃度為 1 mg/ml，－20℃保存，使用前以含0.5%Tween-20的1×PBS稀釋至6μg/ml[9]。LXR治療組每天腹腔注射T0901317（30 mg/kg），注射體積為 0.3 ml，另兩組注射等體積溶劑，連續(xù)注射 7 d；第 8 d，α-GalCer模型組和LXR治療組腹腔注射α-GalCer（40μg/kg），注射體積為0.2 ml，正常對照組注射等體積溶劑。α-GalCer腹腔注射6 h后眼眶取血0.8 ～ 1.0 ml，處死小鼠，于肝臟右葉相同部位留取肝組織，用于后續(xù)實驗。

2.肝臟組織病理學檢查：肝組織4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察。

3.血清轉氨酶水平檢測：以HITACHI 7080全自動生化分析儀檢測血清ALT、AST水平。

4.免疫組化染色檢測IL-6表達：甲醛固定石蠟包埋肝組織4μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2消除內源性過氧化物酶活性，微波抗原修復，封閉液室溫封閉，滴加IL-6抗體（1:100），4℃過夜，滴加二抗，DAB顯色，自來水充分沖洗，蘇木精復染，封片。拍照后以Image-Pro Plus 6.0軟件分析肝組織IL-6陽性物質單位面積內的積分光密度值（IOD），作為IL-6蛋白相對表達量。

5.蛋白質印跡法檢測PI3K/Akt/NF-κB信號通路激活情況：抽提肝組織總蛋白，測定蛋白濃度。電泳，轉膜，封閉，依次一抗、二抗孵育，ECL顯影，定影。掃描圖像，ImageJ 1.42軟件分析肝組織各目的蛋白相對表達量。

6.實時熒光定量RT-PCR檢測TNF-α、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA表達：抽提肝組織總RNA，逆轉錄合成cDNA，以之為模板行實時熒光定量PCR，引物設計采用Primer Express軟件（見表 1）。PCR 循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 10 s；95 ℃ 10 s，60 ℃20 s，81 ℃ 1 s，45 個循環(huán)。以 β-actin 為內參照，2－△△Ct法計算目的基因mRNA相對表達量。以正常對照組表達量為基數(shù)，將α-GalCer模型組和LXR治療組的表達量轉換成與正常對照組的比值表示。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、LXR激活減輕α-GalCer誘導的肝損傷

正常對照組肝組織結構正常，未見明顯淋巴細胞浸潤和肝細胞壞死；α-GalCer模型組肝組織門管區(qū)和小葉內大量淋巴細胞浸潤，肝細胞腫脹壞死明顯；LXR治療組肝組織淋巴細胞浸潤程度明顯輕于α-GalCer模型組，偶見肝細胞壞死（見圖1）。各組血清ALT、AST水平的變化與肝組織病理學改變平行，α-GalCer模型組顯著高于正常對照組，LXR治療組則較α-GalCer模型組顯著降低（見表2）。

表2 各組血清轉氨酶水平比較（x±s,U/L）

二、LXR激活下調肝組織IL-6表達

免疫組化染色顯示，IL-6陽性物質呈棕黃色，主要定位于細胞質。α-GalCer模型組IL-6主要表達于肝細胞中，肝組織IL-6表達量較正常對照組顯著上調（6512.23±356.74 對 98.17±38.59,P<0.01），LXR 治療組（501.46±79.84）則較 α-GalCer模型組顯著下調（P<0.01）（見圖 2）。

三、LXR激活抑制肝內PI3K/Akt/NF-κB信號通路

蛋白質印跡法檢測顯示，各組間肝組織總Akt、 總 IκBα 蛋白表達量無明顯差異，α-GalCer模型組 PI3K p85、p-Akt、p-IκBα、NF-κB p65 蛋 白表達量較正常對照組顯著上調，LXR治療組則較α-GalCer模型組顯著下調（見表3、圖3）。

四、LXR激活下調肝組織TNF-α、iNOSmRNA表達

實時熒光定量RT-PCR檢測顯示，α-GalCer模型組肝組織TNF-α、iNOSmRNA表達量較正常對照組明顯上調，LXR治療組則較α-GalCer模型組顯著下調（TNF-α:2.19±1.34 對 7.31±3.78,P<0.05;iNOS:2.65±1.21 對 5.12±0.67,P<0.05）。

表3 各組肝內PI3K/Akt/NF-κB信號通路相關蛋白表達量比較（±s ）

表3 各組肝內PI3K/Akt/NF-κB信號通路相關蛋白表達量比較（±s ）

*與正常對照組比較，P<0.01；與 α-GalCer模型組比較，△P<0.05，▲P<0.01

組 別 例數(shù) PI3K p85 p-Akt 總Akt p-IκBα 總IκBα NF-κB p65正常對照組 5 0.30±0.02 0.26±0.03 1.00±0.07 0.11±0.01 0.76±0.02 0.37±0.02 α-GalCer模型組 5 0.86±0.01* 0.67±0.05* 1.08±0.07 1.08±0.02* 0.80±0.01 0.89±0.01*LXR 治療組 5 0.75±0.02△ 0.46±0.02▲ 0.99±0.08 0.83±0.01▲ 0.81±0.01 0.72±0.07△

圖3 各組肝內PI3K/Akt/NF-κB信號通路相關蛋白蛋白質印跡法電泳圖

討 論

AIH的病因和發(fā)病機制至今尚未明確。AIH患者肝臟具有典型的界面性肝炎特征，門管區(qū)有大量淋巴細胞浸潤，并有較高水平的促炎細胞因子分泌，表明肝內免疫反應引起的炎癥可能在AIH的發(fā)生、發(fā)展過程中起關鍵作用[10]。因此，通過免疫調節(jié)抑制肝臟炎癥成為治療AIH的重要途徑之一。

理想的動物模型對AIH的研究具有重要意義。伴刀豆球蛋白A（Con A）模型和α-GalCer模型均為經(jīng)典的免疫介導肝損傷小鼠模型。然而，Con A模型的肝臟炎癥并非由自身抗原所誘導，α-GalCer則可作為天然自身抗原的替代抗原被MHC-Ⅰ樣分子CD1d呈遞至NKT細胞[4]。因此α-GalCer模型與Con A模型相比更接近人類自身免疫性肝病，是研究AIH理想的動物模型。

LXR系于1994年從肝cDNA文庫克隆得到，因在肝臟內大量表達而得名，包括LXRα（NR1H3）和LXRβ（NR1H2）兩種亞型。LXRα和LXRβ在組織分布上有一定差異，LXRα在肝臟內高表達，在腎上腺、腸、脂肪組織、巨噬細胞、肺、腎等部位亦有一定水平的表達，LXRβ則在全身廣泛表達。除參與調控膽固醇的吸收、輸出、轉運、分泌等過程，LXR對免疫和炎癥反應亦具有調節(jié)作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)LXR 激活可抑制 Toll樣受體 4（TLR4）、IL-1β、TNF-α等介導的信號通路及其下游炎癥基因表達，可由LXR激動劑抑制的參與免疫反應的炎癥介質、細胞因子、趨化因子等基因包括iNOS、環(huán)氧合酶-2（COX-2）、IL-6、IL-1β、粒細胞集落刺激因子（G-CSF）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、MCP-3、巨噬細胞炎癥蛋白-1β（MIP-1β）、干擾素誘導蛋白-10（IP-10）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）等[6]。T0901317是人工合成的LXR選擇性激動劑，可以同時激活LXRα和LXRβ。LXR激動劑已在多個自身免疫性疾病，如實驗性自身免疫性腦脊髓炎、膠原性關節(jié)炎動物模型中被證實可減輕癥狀、改善炎癥[12,13]，然而關于LXR激活對肝臟自身免疫性炎癥性疾病的保護作用及其機制的研究尚少。本研究首次在α-GalCer誘導的小鼠肝損傷模型中證實LXR激活可調節(jié)免疫反應，抑制肝臟炎癥，從而發(fā)揮肝臟保護作用。

血清轉氨酶活性升高是AIH重要的臨床生化指標，在一定程度上可反映肝損傷的嚴重程度[14]。本研究發(fā)現(xiàn)LXR激活能顯著降低腹腔注射α-GalCer引起的血清ALT、AST水平升高，組織病理學檢查示α-GalCer模型組小鼠肝內大量淋巴細胞浸潤，肝細胞腫脹壞死明顯，而LXR治療組小鼠的淋巴細胞浸潤程度明顯輕于α-GalCer模型組，僅偶見肝細胞壞死，證實肝損傷程度與血清轉氨酶水平的變化相一致。

IL-6為Th17型細胞因子，在肝臟中可由單核細胞、巨噬細胞、肝細胞等產(chǎn)生，是一種促炎細胞因子。研究[15]顯示AIH患者血清IL-6水平顯著升高，并與肝臟炎癥相關。Th17細胞可誘導肝細胞表達IL-6，而IL-6進一步作用于Th17細胞，形成正反饋，這可能是AIH的發(fā)病機制之一。本研究中小鼠腹腔注射α-GalCer后肝細胞IL-6表達顯著上調，而LXR激活可顯著下調α-GalCer引起的肝細胞IL-6分泌，從而調節(jié)免疫反應，抑制肝臟炎癥。

研究表明PI3K/Akt信號通路可負反饋調節(jié)過度的先天免疫和TLR介導的促炎反應[16]，可能與自身免疫性疾病有關[17]，但該信號通路與AIH之間有無聯(lián)系尚無相關報道。PI3K/Akt信號通路激活可誘導IκBα磷酸化，使 NF-κB p65亞基與之解離并向核內易位，從而激活NF-κB的轉錄活性，啟動一系列免疫、炎癥反應相關細胞因子基因表達。本研究發(fā)現(xiàn)α-GalCer腹腔注射可激活肝內PI3K/Akt信號通路，肝組織PI3K、p-Akt表達明顯上調，p-IκBα、NF-κB p65 同時上調，而 LXR 激活可顯著下調α-GalCer引起的上述蛋白表達上調，提示LXR激活可抑制PI3K/Akt信號通路的激活，通過抑制IκBα磷酸化而影響NF-κB的轉錄活性，從而減少促炎細胞因子表達，抑制肝臟炎癥，起到保護肝臟的作用。

TNF-α是介導α-GalCer誘導的肝損傷的重要介質，以抗體中和TNF-α可顯著減輕α-GalCer誘導的肝損傷[4]。TNF-α可通過NF-κB信號通路誘導iNOSmRNA和蛋白表達[18]，而iNOS催化產(chǎn)生的一氧化氮（NO）可介導肝損傷。本研究證實LXR激活可顯著下調α-GalCer腹腔注射引起的肝組織TNF-α、iNOSmRNA表達上調，從而減輕肝損傷。

綜上所述，以LXR激動劑T0901317激活LXR可調節(jié)免疫反應，抑制肝臟炎癥，從而顯著減輕α-GalCer誘導的小鼠肝損傷，提示LXR激動劑對AIH具有潛在治療價值。LXR激活對肝臟的保護機制可能與抑制PI3K/Akt/NF-κB信號通路激活有關。

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