羅必蓉，劉蓉，劉繼芬，唐玲，蔣宏

（成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)教研室，四川 成都 610041）

近年來陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）已成為醫(yī)院感染的重要病原菌，該菌對包括氨基糖苷類在內(nèi)的常用抗生素常呈現(xiàn)多重耐藥性，令抗菌感染治療相當(dāng)困難。為了解成都地區(qū)陰溝腸桿菌耐藥性及氨基糖苷類修飾酶（Aminoglycoside modifying enzymes，AMEs）基因存在情況，我們對臨床分離的33株陰溝腸桿菌進(jìn)行了藥敏實(shí)驗(yàn)，并檢測了9種AMEs基 因：aac（3）－Ⅰ、aac（3）－Ⅱ、aac（3）－Ⅲ、aac（3）－Ⅳ、aac（6′）－Ⅰ、aac（6′）－Ⅱ、ant（3″）－Ⅰ、ant（2″）－Ⅰ、aph（3′）－Ⅵ，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及鑒定

33株試驗(yàn)菌株分離自成都地區(qū)3家醫(yī)院2009年10月至2010年5月住院患者送檢的各種標(biāo)本，其中痰液27份、尿液4份、傷口分泌物2份。采用Bio－Merieux公司API 20E鑒定菌種。標(biāo)準(zhǔn)菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.2 藥敏試驗(yàn)

微量肉湯法，采用美國Bio－Merieux公司產(chǎn)品ATB G－5藥敏試驗(yàn)板，共測試18種抗菌藥物的敏感性。

1.3 基因檢測

采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法檢測AMEs基因，用蛋白酶K消化法制備DNA擴(kuò)增模板。根據(jù)GenBank中已發(fā)布的AMEs基因序列自行設(shè)計(jì)引物，上海生物工程有限公司合成引物；PCR擴(kuò)增引物序列及產(chǎn)物長度見表1。各種靶基因PCR擴(kuò)增體系 為：P1、P2 引 物 各 0.5μmol／L，KCl 10.0 mmol／L，（NH4）2SO48mmol／L，MgCl22mmol／L，Tris－HCl（pH 9.0）10mmol／L，NP40 0.5%，Taq DNA聚合酶1U。全部反應(yīng)體積20μl，其中模板液5μl。熱循環(huán)參數(shù)為93℃預(yù)變性2min，然后93℃30s→55℃30s→72℃60s，共35周期；最后1個(gè)循環(huán)72℃延伸至5min。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，伊凡思藍(lán)（EB）染色，紫外燈下觀察結(jié)果，出現(xiàn)與陽性對照分子相當(dāng)?shù)哪康臈l帶判為陽性。PCR技術(shù)及基因檢測陽性對照由本實(shí)驗(yàn)室篩查并經(jīng)測序證實(shí)，純水為陰性對照。

序列分析PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司測序，并將測得序列與GenBank中已發(fā)布序列進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)

本組菌株多重耐藥性嚴(yán)重，僅對亞胺培南和厄它培南全部敏感。對氨芐西林、氨芐西林／舒巴坦、頭孢替坦耐藥率均在90%以上。對氨基糖苷類3種抗菌藥物阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素的耐藥率分別為33.3%、63.6%、81.8%（表2）。

2.2 9種AMEs基因PCR檢測

9種 AMEs基因陽性率：aac（6′）－Ⅰ、ant（3″）－Ⅰ、aac（3）－II、ant（2″）－Ⅰ、及 aph（3′）－Ⅵ的陽性率分別為：87.8% （29／33）、63.6% （21／33）、54.5%（18／33）、45.4%（15／33）、24.2%（8／33），而aac（3）－Ⅰ、aac（3）－Ⅲ、aac（3）－IV、aac（6′）－II基因均未檢出。

表1 氨基糖苷類修飾酶基因PCR引物序列及產(chǎn)物長度Tab.1 Primers sequences and products length of aminoglycosides modifying enzymes

表2 33株陰溝腸桿菌對18種抗生素的敏感性（株，%）Tab.2 The sensibility of 33strains of E.cloacae.for 18antibiotic

其中26株同時(shí)檢出2種及2種以上AMEs基因陽性，6株僅1種基因陽性，其余1株未檢出任何1種基因。氨基糖苷類抗生素敏感性與基因檢測結(jié)果相關(guān)情況：27株對氨基糖苷類抗生素耐藥菌株中至少存在1種AMEs基因；6株對氨基糖苷類抗生素敏感菌株中，有2株檢測出AMEs基因陽性。本研究對aac（6′）－Ⅰ 、ant（3″）－Ⅰ、aac（3）－II、ant（2″）－Ⅰ、及aph（3′）－ⅥPCR陽性產(chǎn)物各隨機(jī)抽取1株測序，并與GenBank中發(fā)布的序列做比較，結(jié)果一致。圖1為部分AMEs基因PCR產(chǎn)物電泳圖。

圖1 部分AMEs基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 PCR product electrophoretogram of some AMEs

3 討論

陰溝腸桿菌是腸桿菌科中具有代表性的細(xì)菌，可從尿液、痰液、膿液、血液和腦脊液中分離出來。中國醫(yī)院內(nèi)病原菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)資料顯示，陰溝腸桿菌已成為近年來醫(yī)院感染的重要病原菌［1］。該菌的臨床檢出率僅次于大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌而位居第3位，且有逐年上升的趨勢。本研究中從痰液分離的陰溝腸桿菌占被檢菌株總數(shù)的81.8%。

陰溝腸桿菌耐藥株的增多及其耐藥率的攀升日趨嚴(yán)重，使抗感染治療十分困難，甚至導(dǎo)致臨床治療失敗。本研究菌株藥敏結(jié)果表明，陰溝腸桿菌具有較高的耐藥率，并且多重耐藥情況嚴(yán)重。對青霉素類、1～3代頭孢菌素環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明的耐藥率在50%～90%以上，其中對頭孢唑啉耐藥率高達(dá)100%，對阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素3類氨基糖苷類抗生素的耐藥率分別為33.3%、63.6%、81.8%。只對亞胺培南和厄它培南全部敏感，可見對于陰溝腸桿菌，體外活性最好的為碳青酶烯類抗生素。

陰溝腸桿菌對氨基糖苷類抗生素耐藥是通過產(chǎn)氨基糖苷類修飾酶、細(xì)菌16SrRNA甲基化酶、和氨基糖苷類作用靶位16SrRNA基因突變及核糖體蛋白編碼基因突變所致［2］。產(chǎn)氨基糖苷類修飾酶是其耐藥的主要原因。目前，國內(nèi)外有關(guān)陰溝腸桿菌產(chǎn)AmpC酶、TEM、SHV和CTX－M等類型內(nèi)酰胺酶的研究方面有較多報(bào)道［3，4］，但產(chǎn)氨基糖苷類修飾酶的研究報(bào)道甚少［5］，編碼AMEs的基因有30多種，但在革蘭陰性菌中常見的為9種，不同種類的AMEs可使細(xì)菌對同一種抗生素耐藥，一種AMEs可使數(shù)種氨基糖苷抗生素活性下降，形成交叉耐藥［5］。

本研究中AMEs基因陽性率較高的分別是aac（6′）－Ⅰ 87.8% （29／33）、ant（3″）－Ⅰ63.6% （21／33）、aac（3）－II 54.5%（18／33），97%菌株有1種或1種以上基因。多數(shù)基因型與耐藥表型結(jié)果相符，但也有少數(shù)不相符的，如6株對氨基糖苷類抗生素敏感菌株中，有2株檢測出AMEs基因陽性，可能與基因不表達(dá)或表達(dá)不完全有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。

本研究表明，陰溝腸桿菌多重耐藥嚴(yán)重，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)其耐藥性監(jiān)測和耐藥相關(guān)基因的分子流行病學(xué)研究，以利于科學(xué)制定抗感染治療方案，控制多重耐藥菌株的播散。

［1］陳民鈞，王輝.中國重癥監(jiān)護(hù)病房革蘭陰性細(xì)菌耐藥性連續(xù)7年監(jiān)測研究［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2003，83（5）：375.

［2］蔡培泉，過毅.陰溝腸桿菌耐藥相關(guān)基因國內(nèi)5年（2003－2007）研究進(jìn)展［J］.世界感染雜志，2008，8（4）：260.

［3］吳偉元，陳民鈞.陰溝腸桿菌ampD基因突變與去阻遏持續(xù)高產(chǎn) AmpC酶［J］.中國抗感染化療雜志，2001，1（2）：65.

［4］佘丹陽，劉又寧.AmpC酶和超廣譜β－內(nèi)酰胺酶在陰溝腸桿菌中的表達(dá)及對其耐藥性的影響［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2002，82（19）：1355.

［5］黃支密，糜祖煌，秦玲，等.20株陰溝腸桿菌耐藥性及氨基糖苷類修飾酶基因型分析［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2005，25（5）：428.