韋桂寧，何德明，宋大彥，李艷，梁寧生#(.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，南寧市5002；2.廣西中醫(yī)藥研究院，南寧市50022；.石家莊醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥理教研室，石家莊市05008)

近年來，無論在國(guó)內(nèi)還是國(guó)外，真菌感染率均有上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重地威脅著人類的健康。與抗細(xì)菌感染藥物相比，抗真菌藥物存在種類少、選擇性小、毒副作用大的缺點(diǎn)[1]，故加緊研究和開發(fā)新型高效、低毒、廣譜的抗真菌藥物迫在眉睫。脊椎動(dòng)物除天然擁有一整套高度特異性的、以細(xì)胞為核心的免疫系統(tǒng)外，還擁有一套由不同的抗菌蛋白/肽組成的高效、廣譜的防御系統(tǒng)。與傳統(tǒng)的抗生素相比，抗菌蛋白/肽具有殺菌快速、廣譜且致病菌很難對(duì)其產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)[2，3]。

本文以大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，腹腔注射金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)菌性感染的炎癥模型，收集其腹腔炎癥滲出液，經(jīng)過離心得到富含蛋白的上清液。以常見的真菌如白色念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌為研究目標(biāo)，研究該上清液對(duì)真菌的殺菌作用。觀察溫度對(duì)該上清液抗白色念珠菌作用的影響，并在顯微鏡下觀察該上清液對(duì)白色念珠菌的殺滅過程。由此，為新型天然抗真菌藥物的研究提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

THZ-C恒溫振蕩器、HWS-20恒溫水浴箱(江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠)；721分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)；顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 試藥

RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco-Brl公司)；LB培養(yǎng)基粉(上海生工生物工程有限公司)；沙保羅氏瓊脂(杭州天和微生物試劑有限公司)；小牛血清白蛋白(BSA，武漢生命技術(shù)有限公司分裝)。

1.3 動(dòng)物

Wistar大鼠，♂，體重(300±50)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK桂2003-0003。

1.4 菌株

金黃色葡萄球菌(廣西醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，批號(hào):ATCC26003)；白色念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌(均從廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院疑似相應(yīng)念珠菌感染的8名患者身上分離得到，菌株分離純化后經(jīng)鑒定確認(rèn))。

2 方法

2.1 金黃色葡萄球菌液的制備

制備對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期金黃色葡萄球菌，即挑取少量菌種接種于新鮮LB培養(yǎng)液中，37℃、190 r·min－1振搖過夜。將過夜培養(yǎng)液按1∶50接入新鮮LB培養(yǎng)液中，37℃、190 r·min－1振搖，2.5 h后將培養(yǎng)液取出，4000 r·min－1離心50 s，棄上清液，用生理鹽水稀釋后，用吸光度法測(cè)定金黃色葡萄球菌液菌落數(shù)，然后用生理鹽水稀釋成所需的濃度，待用。

2.2 建模[4]

取大鼠20只，隨機(jī)分為模型組和正常對(duì)照組，每組10只。模型組大鼠腹腔注射金黃色葡萄球菌液(3.6×108cfu·mL－1)建立細(xì)菌性感染模型，于24 h后處死大鼠，打開腹腔，收集腹腔滲出液，即細(xì)菌性腹腔炎癥滲出液(簡(jiǎn)稱滲出液)。將收集的滲出液1000 r·min－1離心5 min，收集上清液，即細(xì)菌性腹腔炎癥滲出液的上清液(簡(jiǎn)稱上清液)。沉淀的細(xì)胞部分用生理鹽水沖洗3次，最后用RPMI-1640反應(yīng)液(20 mol·L－1羥乙基哌嗪乙硫磺酸(Hepes)、1%小牛血清白蛋白、2.5 mol·L－1氯化鈣，pH7.4)稀釋到原來的容積，即得細(xì)菌性腹腔炎癥滲出液的細(xì)胞液(簡(jiǎn)稱細(xì)胞液)。正常對(duì)照組除注射生理鹽水外，其余操作同模型組。

2.3 滲出液、細(xì)胞液、上清液對(duì)白色念珠菌的殺菌試驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)[5]，采用瓊脂鋪板計(jì)數(shù)法，具體步驟如下:(1)取過夜培養(yǎng)的白色念珠菌菌液，按1∶50加入新鮮LB培養(yǎng)液中，在37℃搖床中振搖孵育5～8 h(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)。(2)離心收集白色念珠菌，同時(shí)將滲出液、細(xì)胞液、上清液分別稀釋成20%、4%、0.8%，再將上述稀釋液與白色念珠菌加入RPMI-1640反應(yīng)液中(終濃度均為1×106cfu·mL－1)，總體積為100 μL，混勻后置于37℃水浴。(3)水浴2 h后取出孵浴液50 μL，加生理鹽水450 μL，連續(xù)10倍稀釋，共4次。每1倍數(shù)稀釋液都取出100 μL的稀釋液至無菌培養(yǎng)皿(直徑55 mm)中，再加入經(jīng)高溫消毒后50℃保溫的沙保羅氏瓊脂培養(yǎng)基5 mL，待瓊脂冷卻后，將培養(yǎng)皿放入約37℃溫箱培養(yǎng)，72 h后取出并計(jì)算白色念珠菌菌落數(shù)，與未加入上清液/滲出液/細(xì)胞液的空白對(duì)照比較，計(jì)算不同濃度上清液的殺菌率(殺菌率＝(空白對(duì)照組白色念珠菌數(shù)－各濃度白色念珠菌數(shù))/空白對(duì)照組白色念珠菌數(shù)×100%)。

2.4 上清液對(duì)真菌的殺菌作用[4]

計(jì)算20%、4%、0.8%上清液對(duì)白色念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌的殺菌率，除“(2)離心收集白色念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌，將上清液與白色念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌加入RPMI-1640反應(yīng)液”外，其余操作同“2.3”項(xiàng)。

2.5 溫度對(duì)上清液殺菌作用的影響

取上清液制備成含20%上清液的反應(yīng)體系，分別在36、56℃水浴10 min，然后按“2.3”項(xiàng)下方法對(duì)白色念珠菌做殺菌試驗(yàn)。

2.6 上清液對(duì)白色念珠菌的殺滅過程

根據(jù)文獻(xiàn)[6]方法，取上清液制備成含80%上清液的反應(yīng)體系，在37℃、40倍顯微鏡下，分別觀察作用前和作用30、120 min時(shí)白色念珠菌菌體形態(tài)的變化，并照相記錄。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以±s表示，采用方差分析，P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠腹腔滲出液比較

正常對(duì)照組大鼠注射生理鹽水12 h后，生理鹽水被腹腔幾乎完全吸收，因此12 h以后收集不到滲出液，為對(duì)照觀察模型組滲出液的情況，筆者用300 μL生理鹽水沖洗腹腔，然后收集沖洗液，作為正常對(duì)照組滲出液，但在殺菌試驗(yàn)中不設(shè)此正常對(duì)照組。模型組大鼠給藥24 h有大量滲出液滲出，有大量白細(xì)胞滲出，上清液中含有大量蛋白，結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠腹腔滲出液的量、白細(xì)胞濃度和蛋白含量比較(±s，n＝8)Tab 1Comparison of the content of peritoneal exudates，the concentration of white cell and protein in peritoneal exudates in rat(s±s，n＝8)

表1 各組大鼠腹腔滲出液的量、白細(xì)胞濃度和蛋白含量比較(±s，n＝8)Tab 1Comparison of the content of peritoneal exudates，the concentration of white cell and protein in peritoneal exudates in rat(s±s，n＝8)

與正常對(duì)照組比較:＊P＜0.01vs.normal control group:＊P＜0.01

蛋白含量/mg·mL－1 5.41±0.85＊1.62±0.21組別模型組正常對(duì)照組滲出液的量/mL 3900.0±580.8＊270.5±55.5白細(xì)胞濃度/×106個(gè)·mL－1 35.0±4.0＊2.0±0.7

3.2 滲出液、上清液和細(xì)胞液對(duì)白色念珠菌的殺菌作用

滲出液、上清液和細(xì)胞液對(duì)白色念珠菌都有不同程度的殺菌作用，其中滲出液最強(qiáng)，在0.8%(V/V)時(shí)，與上清液或細(xì)胞液比較，殺菌作用明顯更強(qiáng)(P＜0.01)；上清液與細(xì)胞液對(duì)白色念珠菌的殺菌作用比較沒有顯著性差異(P＞0.05)，結(jié)果見表2。

表2 滲出液、上清液和細(xì)胞液對(duì)白色念珠菌的殺菌作用比較(±s，n＝8)Tab 2Antifungal activity of peritoneal exudates，supernatant against Candida albican(sx ±s，n＝8)

表2 滲出液、上清液和細(xì)胞液對(duì)白色念珠菌的殺菌作用比較(±s，n＝8)Tab 2Antifungal activity of peritoneal exudates，supernatant against Candida albican(sx ±s，n＝8)

與相應(yīng)濃度滲出液比較:＊P＜0.01vs.exudates with same concentration:＊P＜0.01

樣本類型滲出液上清液細(xì)胞液殺菌率/%0.8%(V/V)63.74±9.7634.19±8.70＊36.90±7.75＊20%(V/V)98.47±1.5297.35±1.3896.83±2.894%(V/V)93.46±5.8389.75±8.7886.12±9.93

3.3 上清液對(duì)真菌的殺菌作用

模型組大鼠的上清液對(duì)白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌有很強(qiáng)的殺菌作用，反應(yīng)體系含20%的上清液時(shí)，上清液的殺菌率都在93%以上；當(dāng)上清液被稀釋25倍(4%)后，上清液的殺菌率仍在60%以上，具體結(jié)果見表3。

表3 不同濃度的上清液對(duì)真菌的殺菌作用比較(±s，n＝8)Tab 3Comparison of antifungal activity of peritoneal exudates supernatant on fungu(s±s，n＝8)

表3 不同濃度的上清液對(duì)真菌的殺菌作用比較(±s，n＝8)Tab 3Comparison of antifungal activity of peritoneal exudates supernatant on fungu(s±s，n＝8)

0.8%上清液34.19±8.7025.19±11.4229.85±12.36菌種白色念珠菌光滑念珠菌熱帶念珠菌殺菌率/%20%上清液97.35±1.3893.42±5.1698.61±1.044%上清液69.75±8.7860.90±10.5463.40±8.86

3.4 溫度對(duì)上清液殺菌作用的影響

含20%上清液的反應(yīng)體系經(jīng)過56℃水浴10 min后，對(duì)白色念珠菌的殺菌作用由36℃水浴的(97.35±1.38)%下降到(8.71±3.42)%，殺菌作用幾乎完全喪失。提示上清液中的抗真菌物質(zhì)對(duì)熱不穩(wěn)定。

3.5 上清液對(duì)白色念珠菌的殺滅過程

鏡下觀察表明，上清液作用前，白色念珠菌形態(tài)正常，胞體橢圓形；作用30 min后，白色念珠菌菌體逐漸變小，胞壁漸模糊；作用120 min后，白色念珠菌菌體破碎成碎片，大部分已死亡。上清液作用前、后白色念珠菌菌體的形態(tài)變化見圖1。

4 討論

大鼠腹腔受到細(xì)菌性感染刺激以后，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，引起感染的部位血管通透性升高，血流動(dòng)力學(xué)改變，炎癥細(xì)胞滲出，血漿滲入腹腔，產(chǎn)生大量腹腔滲出液，其上清液中含有大量蛋白。上清液對(duì)常見的致病真菌如白色念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌均有很強(qiáng)的殺菌作用，且殺菌作用受溫度的影響，56℃可使其幾乎完全喪失對(duì)真菌的殺菌作用。上清液對(duì)白色念珠菌作用后，白色念珠菌菌體縮小，最后菌體破碎而死亡。這提示，上清液中存在強(qiáng)抗真菌物質(zhì)，且其抗真菌作用受到溫度的影響；其對(duì)真菌所具有的強(qiáng)殺菌作用的機(jī)制可能是通過影響微生物細(xì)胞壁/細(xì)胞膜的直接作用，改變其通透性，造成其物理性損傷，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外滲而死亡。

目前，生物體內(nèi)已知有抗菌作用的蛋白有乳鐵蛋白(LF)、組織蛋白酶G、防御素、磷脂酶A2等。LF首先由Groves在1960年從牛乳中分離獲得。其在酸性條件下非常穩(wěn)定，在pH值為4.0、溫度為90℃加熱處理5 min，抗菌作用保持不變。因此，56℃溫度對(duì)于其對(duì)白色念珠菌的殺菌作用的影響不是很大。組織蛋白酶G對(duì)真菌的殺菌作用在56℃不受影響。防御素是廣泛分布于動(dòng)物和植物界的一類富含半胱氨酸的陽離子內(nèi)源性抗微生物肽。研究表明，大鼠的防御素和人的防御素一樣對(duì)白色念珠菌沒有殺菌作用，而且其是小分子多肽，對(duì)熱也很穩(wěn)定。磷脂酶A2對(duì)革蘭陽性細(xì)菌具有極強(qiáng)的殺菌作用[7]，但是筆者同期研究表明，磷脂酶A2對(duì)白色念珠菌沒有殺菌作用。因此，上清液中的抗真菌物質(zhì)是已知的幾種抗真菌蛋白的可能性很小，這就提示腹腔滲出液中存在著未知的抗真菌物質(zhì)，很有可能是分子量比較大、對(duì)熱不穩(wěn)定的蛋白。

上清液中抗菌蛋白/肽，其來源及性質(zhì)、肽鏈的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)能否人工改造或合成，很值得進(jìn)一步研究，這也為天然抗真菌藥物的開發(fā)提供了思路。

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