蔡自由，李永沖，陳纘光（.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣州市50520；2.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣州市50006）

溴吡斯的明（Pyridostigmine bromide）是一種有效的膽堿酯酶抑制藥。文獻(xiàn)報道的有關(guān)溴吡斯的明片含量測定的方法有紫外-可見分光光度法[1]、高效液相色譜（HPLC）法[2～5]等。紫外-可見分光光度法的選擇性相對較低；HPLC法分析成本高、樣品處理較煩瑣，且流動相多為有毒溶劑。采用微流控芯片分析目前國內(nèi)、外尚未見報道。筆者采用微流控芯片非接觸電導(dǎo)檢測法[6]測定溴吡斯的明片中溴吡斯的明的含量，與傳統(tǒng)方法相比具有簡便快速、樣品前處理簡單、重復(fù)性好的特點，為其檢測提供了一種比較方便、準(zhǔn)確、有效的新方法。

1 儀器與試藥

PMMA十字通道芯片（大連理工大學(xué)微系統(tǒng)研究中心，微通道上寬30 μm，下寬100 μm，深30 μm，進(jìn)樣通道為十字結(jié)構(gòu)，分離通道長44 mm，有效分離長度43 mm）；微型壓電陶瓷高壓電源（自制）[7]；非接觸電導(dǎo)檢測器（自制）[6]；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏儀市英峪予華儀器廠）；色譜工作站（中山大學(xué)醫(yī)藥儀器與應(yīng)用研究所），數(shù)據(jù)記錄與處理在普通P4微機(jī)上完成。

溴吡斯的明對照品（海南凱健制藥有限公司，純度＞99.99%）；溴吡斯的明片（上海中西三維制藥有限公司，批號：20090606、20101004、20101005、20101006，規(guī)格：60 mg）；2-（N-嗎啉代）乙磺酸（MES）（香港AMRES公司）；三（羥甲基）氨基甲烷（Tris）（Farca Chemical Supplies，優(yōu)級純）；水為二次蒸餾水，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗條件

緩沖體系：1 mmol·L－1HAc+1 mmol·L－1NaAc（pH 4.5）；分離電壓：1.80 kV；進(jìn)樣時間：10.0 s；不加添加劑；非接觸電導(dǎo)檢測器激發(fā)電壓：60 V（Vp-p），頻率：60 kHz。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取溴吡斯的明對照品0.010 0 g，用二次蒸餾水溶解并定容于10 mL容量瓶中，得1.00 mg·mL－1溴吡斯的明對照品溶液，4℃下保存，臨用時稀釋成各濃度的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取溴吡斯的明片20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于溴吡斯的明0.012 g），置于200 mL容量瓶中，加水約100 mL，充分振搖使溴吡斯的明溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，得溴吡斯的明片供試品溶液。

2.3 線性關(guān)系考察和檢出限

制備濃度為 1.0～200 μg·mL－1的系列對照品溶液，按“2.1”項下試驗條件測定。以溴吡斯的明峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X，μg·mL－1）為橫坐標(biāo)，得線性方程Y＝1 887.8X－1 241.3（r＝0.999 7）。結(jié)果表明，溴吡斯的明質(zhì)量檢測濃度在10～100 μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系，檢出限為0.6 μg·mL－1（S/N＝3）。

2.4 精密度試驗

準(zhǔn)確吸取1.00 mg·mL－1溴吡斯的明對照品溶液5.00 mL，加水稀釋100 倍，得50 μg·mL－1溴吡斯的明對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，按“2.1”項下試驗條件測定。結(jié)果，溴吡斯的明峰面積的RSD＝1.9%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

按“2.2.2”項下方法制備溴吡斯的明供試品（批號：20090606）溶液，4 ℃下保存，按“2.1”項下試驗條件，分別于0、2、4、6、8 h進(jìn)樣測定。結(jié)果，溴吡斯的明峰面積RSD＝2.0%，表明測定液在4℃下放置8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 加樣回收率試驗

精密量取溴吡斯的明片供試品（批號：20101005）溶液（59.5 μg·mL－1）5.00 mL 3份，分置于10 mL容量瓶中，分別按供試品含量的80%、100%、120%加入溴吡斯的明對照品溶液（1.00 mg·mL－1）238、298、358 μL，加水稀釋并定容至10.0 mL，分別進(jìn)樣3次，測定結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝3）Tab 1 Results of content determination of PBT samples（n＝3）

2.7 樣品含量測定

取溴吡斯的明供試品（批號：20090606）溶液和對照品溶液適量，分別進(jìn)樣，記錄電泳圖（見圖1）。結(jié)果，電泳譜圖基本一致，說明供試品輔料不出峰，對本法測定溴吡斯的明不干擾，故未設(shè)陰性對照。

圖1 芯片毛細(xì)管電泳譜圖Fig 1 Capillary electrophotogram of microfluidic chip

取3批供試品（批號：20101004，20101005，20101006）溶液適量，分別進(jìn)樣，記錄電泳圖，根據(jù)“2.3”項下線性方程計算出溴吡斯的明片含溴吡斯的明（C9H13BrN2O2）的標(biāo)示量，結(jié)果見表2。

表2 溴吡斯的明片樣品含量測定結(jié)果Tab 2 Results of recovery test

3 討論

3.1 緩沖溶液

筆者考察了不同緩沖體系對溴吡斯的明分離檢測的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在MES-Tris、Tris-HC1、Tris-HAc、Tris-H3BO3、檸檬酸-檸檬酸鈉、三乙胺-H3PO4等緩沖溶液中，溴吡斯的明不出峰，其原因可能是上述各種緩沖液的電導(dǎo)與樣品的電導(dǎo)相差不大導(dǎo)致；在MES-His、Tris-His等緩沖溶液中出峰高，但與水峰或雜峰相連；在二乙胺-H3PO4、NaH2PO4-Na2HPO4等緩沖體系中出峰高，但峰形不好，且與雜峰相連；在三乙胺-H3BO3、HAc-NaAc、二乙胺-H3BO3、硼砂-H3BO3等緩沖體系中出峰高，且峰形和分離度都較好。綜合考慮峰形、峰高、分離度、基線和噪聲等因素，選擇了HAc-NaAc緩沖體系，如圖2所示。

圖2 溴吡斯的明在不同緩沖溶液中的芯片毛細(xì)管電泳譜圖Fig 2 Capillary electrophotogram of PB in different buffer solutions

試驗還考察了HAc和NaAc濃度和配比的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著總體濃度的增大，電流也隨著增大，焦耳熱效應(yīng)使基線噪聲也隨之增加；HAc和NaAc配比不同，緩沖體系pH會影響溴吡斯的明出峰的峰形和峰高。在c（HAc）∶c（NaAc）＝1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、2∶1、2∶2、2∶3、2∶4、3∶1、3∶2、3∶3、3∶4、4∶1、4∶2、3∶4和4∶4 mmol·L－1的緩沖體系中，都能實現(xiàn)溴吡斯的明分離。綜合考慮峰形、峰高、分離度、基線和噪聲等因素，優(yōu)化選擇1 mmol·L－1HAc+1 mmol·L－1NaAc（pH 4.5）作為緩沖體系。

3.2 添加劑

考察了不同種類的添加劑，如甲醇、乙醇、十二烷基硫酸鈉（SDS）、β-環(huán)糊精（β-CD）等不同加入量對分離檢測（噪聲、拖尾因子、靈敏度和分離度）的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入0.1～0.5 mmol·L－1SDS對靈敏度有提高，但遷移時間明顯縮短，樣品峰與雜峰相連，隨著其濃度的增加，離子強(qiáng)度增大，電滲流亦增大，遷移時間變得更小，而且噪聲隨之增大，基線漂移亦隨之明顯。加入體積分?jǐn)?shù)1～10%甲醇和1～10%乙醇，遷移時間隨體積分?jǐn)?shù)增加而增大，檢測靈敏度隨之降低。加入β-CD 0.1～1.0 mmol·L－1對分離檢測無改善。綜合分離檢測效果，優(yōu)化選擇不加添加劑。

3.3 分離電壓

試驗考察了分離電壓（1.00 kV～3.00 kV）對分離和檢測的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著分離電壓的升高，樣品出峰時間縮短，電流增大，噪聲也增大。升高分離電壓，遷移時間明顯縮短，有利于加快分析速度，但樣品峰逐漸與雜峰相連，分離度變差，不利于分離；同時，電流增大，焦耳熱亦增大，會導(dǎo)致噪聲大幅度增加。綜合考慮分離度、峰形、噪聲等因素，優(yōu)化選擇分離電壓為1.80 kV。

3.4 進(jìn)樣時間

在其他因素相同的條件下，考察了進(jìn)樣時間對分離和檢測的影響。結(jié)果表明，進(jìn)樣時間在5.0 s～20.0 s范圍，當(dāng)進(jìn)樣時間延長時，峰高與峰面積呈增大趨勢。但當(dāng)進(jìn)樣時間超過15.0 s后，峰高增加的幅度減少，分離效果變差，而且隨著進(jìn)樣時間的增加，一些不利因素如峰展寬和峰形拖尾等影響變得顯著。綜合考慮，優(yōu)化的進(jìn)樣時間為10.0 s。

綜上所述，微流控芯片非接觸電導(dǎo)檢測法測定溴吡斯的明片中溴吡斯的明的含量，方法簡便快速，重復(fù)性好，可用于溴吡斯的明片的質(zhì)量控制。

[1] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：820.

[2] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：1 090.

[3] 王麗君，王東凱，黎 玲，等.溴吡斯的明注射液的制備及其含量測定[J].中國新藥雜志，2007，16（11）：881.

[4] 付文煥，施孝金，李中東，等.人血漿中溴吡斯的明濃度的RP-HPLC測定法[J].中國藥學(xué)雜志，2007，42（12）：924.

[5] 張大富.反相離子對色譜法測定溴吡斯的明的血藥濃度及生物等效性研究[J].中南藥學(xué)，2009，7（4）：285.

[6] Chen Zuanguang，Li Quanwen，Li Oulian，et al.A thin cover glass chip for contactless conductivity detection in microchip capillary electrophoresis[J].Talanta，2007，71（5）：1 944.

[7] 陳纘光，王立世，莫金垣.微全分析系統(tǒng)專用微型電源的研制[J].高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報，2004，25（增刊）：26.