劉 丹，毋福海，曾承輝（廣東藥學院，廣州市 510224）

三黃片是由大黃、黃芩浸膏、鹽酸小檗堿制成的中藥成方制劑，具有清熱解毒、瀉火通便等功效，臨床用于三焦熱盛所致的目赤腫痛、口鼻生瘡、咽喉腫痛、牙齦腫痛、心煩口渴、尿黃、便秘等的治療，亦用于急性胃腸炎、痢疾的治療。其現(xiàn)行標準采用高效液相色譜（HPLC）法測定黃芩苷、鹽酸小檗堿、大黃素和大黃酚的含量[1]，有采用HPLC法測定三黃片中大黃素、大黃酚、黃芩苷和鹽酸小檗堿含量的報道[2～12]，亦有膠束電動毛細管色譜法測定三黃片中3種蒽醌類活性成分含量的報道[13]，但采用毛細管電泳法同時測定三黃片中多種有效成分的方法尚未見報道。為此，筆者建立了同時測定三黃片中漢黃芩苷（Wogonoside）、漢黃芩素（Wogonin）、大黃素（Emodin）、蘆薈大黃素（Aloe-emodin）、大黃酸（Rhein）、大黃酚（Chrysophanol）、大黃素甲醚（Physcion）含量的毛細管電泳法，為更好地控制三黃片的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

CL1030型高效毛細管電泳儀（北京彩陸科學儀器有限公司）；K-2501紫外-可見檢測器（德國KNAUER公司）；HW-2000色譜工作站2.17版（南京千譜軟件有限公司）；未涂層彈性融硅石英毛細管柱（河北銳年永灃色譜器件有限公司，55 cm×75μm ID）。

漢黃芪苷對照品（安徽蕪湖甙爾塔醫(yī)藥科技有限公司，純度：98.0%）；漢黃芩素對照品（批號：111514-200403）、大黃素對照品（批號：110756-200110）、蘆薈大黃素對照品（批號：110795-200504）、大黃酸對照品（批號：0757-200206）、大黃酚對照品（批號：110796-200513）、大黃素甲醚對照品（批號：110758-200610）、對乙酰氨基酚（paracetamol）對照品（批號：100018-200408）均購自中國藥品生物制品檢定所；三黃片（河南創(chuàng)新藥業(yè)有限公司，批號：0705321、0705101、0803221，規(guī)格：每片0.26 g）；磺丁基-β-環(huán)糊精（磺丁基-β-CD，山東新大精細化工有限公司，含量：99%，批號：080101）；水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 內(nèi)標貯備液的制備 精密稱取適量對乙酰氨基酚對照品，加甲醇溶解稀釋，制成250μg·mL－1的內(nèi)標貯備液。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取漢黃芩苷、漢黃芩素、大黃酚對照品12.9、12.5、22.5 mg，各置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，得濃度分別為252、250、450 μg·mL－1的漢黃芩苷、漢黃芩素、大黃酚對照品貯備液。精密稱取大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚對照品20、15、25、12.5 mg，分別置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，得濃度分別為200、150、250、125 μg·mL－1的大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚對照品貯備液。精密移取漢黃芩苷、漢黃芩素、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚對照品貯備液10、5、10、10、10、20、10 mL，置于同一100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度分別為25.2、12.5、20、15、25、90、12.5 μg·mL－1的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取三黃片20片，除去包衣，精密稱定，研細，求得平均片重。取約0.15 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，加30 mL乙醇，超聲處理1 h，濾過，水浴揮干乙醇，冷卻，殘渣加甲醇溶解并定量轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加入1.0 mL內(nèi)標貯備液，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.1.4 陰性對照溶液的制備 取處方組成中除大黃和黃芩浸膏外的其他成分，按“2.1.3”項下供試品溶液制備方法制成不含黃芩和大黃的陰性對照溶液。

2.1.5 運行緩沖液的制備 精密稱取1.802 4 g硼砂、2.383 6 g十二烷基磺酸鈉（SDS）、1.349 2 g磺丁基-β-CD，置于250 mL量瓶中，加甲醇20 mL，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm濾膜過濾，作為運行緩沖液。

2.2 電泳條件

毛細管柱：未涂層彈性融硅石英柱（55 cm×75μm ID，有效長度 47 cm）；運行緩沖液：25 mmol·L－1硼砂溶液+25 mmol·L－1SDS+4 mmol·L－1磺丁基-β-CD+8%甲醇（pH 9.42）；分離電壓：14 kV；重力進樣時間：5 s（高度：15 cm）；檢測波長：254 nm；溫度：25℃；濕度＜70%。毛細管柱在使用前依次用0.1 mol·L－1氫氧化鈉溶液、水、運行緩沖液各沖洗約5 min。在此條件下，對照品、供試品、陰性對照的色譜見圖1。

2.3 線性關(guān)系考察

分別吸取一定量的混合對照品溶液，加甲醇稀釋成漢黃芩苷、漢黃芩素、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚濃度分別為2.02、5.04、10.08、15.12、20.16 μg·mL－1，1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μg·mL－1，1.6、4.0、8.0、12.0、16.0 μg·mL－1，1.2、3.0、6.0、9.0、12.0 μg·mL－1，2.0、5.0、10.0、15.0、20.0μg·mL－1，7.2、18.0、36.0、54.0、72.0 μg·mL－1和 1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μg·mL－1，內(nèi)標濃度為25 μg·mL－1的溶液。分別進樣，以對照品與內(nèi)標峰面積的比值（R）為縱坐標，對照品溶液濃度（C）為橫坐標，進行線性回歸，分別得回歸方程R1＝0.035 8c+0.038 6（r＝0.999 6）、R2＝0.072 6C+0.025 3（r＝0.999 3）、R3＝0.060 8C+0.093 8（r＝0.999 6）、R4＝0.123 7C+0.048 6（r＝0.999）、R5＝0.063 4C+0.088 3（r＝0.999 5）、R6＝0.149 2C+0.423 6（r＝0.998 6）、R7＝0.146 4C+0.034 0（r＝0.998 1）。結(jié)果表明，漢黃芩苷、漢黃芩素、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚檢測濃度分別在2.02～20.16、1.0～10.0、1.6～16.0、1.2～12.0、2.0～20.0、7.2～72.0、1.0～10.0 μg·mL－1范圍內(nèi)與各自峰面積積分值的線性關(guān)系良好。

圖1 毛細管電泳色譜圖Fig 1 Capillary electrophoresis chromatograms

2.4 精密度試驗

取濃度分別為10.08、5.0、8.0、6.0、10.0、36.0、5.0 μg·mL－1的漢黃芩苷、漢黃芩素、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚對照品溶液適量，分別進樣，連續(xù)測定5次，記錄峰面積并計算RSD。結(jié)果，漢黃芩苷、漢黃芩素、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚的RSD分別為2.00%、0.98%、1.95%、0.98%、1.86%、1.60%、1.93%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液（批號：0705321）適量，于0、2、4、6、8、10、12 h分別進樣，記錄峰面積并計算RSD。結(jié)果，漢黃芩苷、漢黃芩素、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚的RSD分別為2.52%、2.02%、1.30%、3.13%、2.15%、2.14%、1.00%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復性試驗

取同一批號（批號：0705321）樣品適量，共6份，按“2.1.3”項下方法提取、測定。結(jié)果，漢黃芩苷的平均含量為0.58 mg·g－1，RSD＝2.65%（n＝6）；漢黃芩素的平均含量為0.25 mg·g－1，RSD＝2.04%（n＝6）；大黃素的平均含量為 0.56 mg·g－1，RSD＝1.73%（n＝6）；蘆薈大黃素的平均含量為0.40 mg·g－1，RSD＝1.49%（n＝6）；大黃酸的平均含量為 0.64 mg·g－1，RSD＝1.63%（n＝6）；大黃酚的平均含量為 2.39 mg·g－1，RSD＝2.59%（n＝6）；大黃素甲醚的平均含量為0.35 mg·g－1，RSD＝1.00%（n＝6）?？梢姡痉ň芏攘己?。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取同一批號（批號：0705321）樣品適量，共6份，加入一定量的漢黃芩苷、漢黃芩素、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚對照品，按“2.1.3”項下方法處理并測定，計算回收率，結(jié)果見表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7。由上表可見，漢黃芩苷平均回收率為100.7%，RSD＝1.17%；漢黃芩素平均回收率為98.1%，RSD＝1.51%；大黃素平均回收率為99.9%，RSD＝2.78%；蘆薈大黃素平均回收率為101.3%，RSD＝1.48%；大黃酸平均回收率為99.8%，RSD＝2.76%；大黃酚平均回收率為102.0%，RSD＝2.61%；大黃素甲醚平均回收率為101.8%，RSD＝2.01%。

表1 漢黃芩苷加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 1Results of Wogonoside recovery experiment（n＝6）

表2 漢黃芩素加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 2Results of Wogonin acid recovery experimen（tn＝6）

表3 大黃素加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 3 Results of emodin acid recovery experiment（n＝6）

2.8 樣品含量測定

取3批三黃片樣品適量，按“2.1.3”項下方法處理并測定，記錄峰面積，代入回歸方程，計算樣品中7組分的含量，結(jié)果見表8。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

大黃中重要的活性成分是蒽醌類化合物及其衍生物，黃芩含有黃酮成分，7種成分化學結(jié)構(gòu)不盡相同，其紫外吸收亦不相同，為了保證各成分都具有適宜的靈敏度，筆者測定了7種成分在甲醇中的紫外吸收光譜。結(jié)果，漢黃芩苷在270 nm波長處有最大吸收，漢黃芩素在276.5 nm波長處有最大吸收，而大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚在254 nm波長處均有最大吸收。綜合考慮，選擇254 nm為測定波長。

表4 蘆薈大黃素加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 4 Results of aloe-emodin acid recovery experiment（n＝6）

表5 大黃酸加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 5Results of rehein acid recovery experiment（n＝6）

表6 大黃酚加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 6 Results of chrysophanol acid recovery experiment（n＝6）

表7 大黃素甲醚加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 7Results of physcion acid recovery experiment（n＝6）

表8 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，μg·mL－1）Tab 8 Results of content determination of samples（n＝3，μg·mL－1）

3.2 內(nèi)標物的選擇

為克服毛細管電泳重現(xiàn)性差的缺點，筆者采用內(nèi)標法定量。因所測物質(zhì)為黃酮、蒽醌類成分，均為陰離子，因此須找到一種陰離子物質(zhì)作為內(nèi)標，嘗試過的物質(zhì)有對氨基苯甲酸、對氨基苯磺酸、布諾芬、布比卡因、橙皮苷，但是都因為與被測物質(zhì)出峰時間太接近，達不到很好的分離效果。綜合考慮，最后確定對乙酰氨基酚，因其與被測7種物質(zhì)性質(zhì)相近，且對其他物質(zhì)出峰無干擾，可以作為內(nèi)標。

3.3 電泳條件的選擇

3.3.1 硼砂濃度的影響 鑒于漢黃芩苷、漢黃芩素、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚均為弱酸性的多羥基化合物，應選擇堿性緩沖體系。硼砂能與多羥基化合物形成配位鍵，增加負電性，是分離這7種物質(zhì)的良好體系。當SDS濃度為25 mmol·L－1、磺丁基-β-CD濃度為4 mmol·L－1、甲醇比例為8%時，分別考察硼砂濃度為20、25、30 mmol·L－1時對各成分分離的影響。試驗中發(fā)現(xiàn)，當硼砂濃度為20 mmol·L－1時，大黃素甲醚無有效淌度，而且此時基線不穩(wěn)，其余分析物峰形較差。而當硼砂濃度為30 mmol·L－1時，時間窗口增大，分離度有所改善，但同時電流增大，保留時間也增加了。只有當硼砂濃度為25 mmol·L－1時，各分析物的峰形都較好，且能達到基線分離，并都能在30 min內(nèi)完成分離測定。綜合分離情況，分析時間、電流等因素，確定硼砂的濃度為25 mmol·L－1。

3.3.2 SDS濃度的影響 當硼砂濃度為25 mmol·L－1，磺丁基-β-CD濃度為4 mmol·L－1，甲醇比例為8%時，討論SDS濃度在5～30 mmol·L－1范圍內(nèi)變化時對分析物遷移時間的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當SDS濃度＜25 mmol·L－1時，漢黃芩苷、漢黃芩素可以基線分離，大黃素和蘆薈大黃素不能基線分離，其余分析物的峰形差。隨著SDS濃度的增大，各分析物的峰形越來越好，在25 mmol·L－1時達到最佳。而超過此濃度，如在30 mmol·L－1時，各分析物的峰形開始變差，基線不穩(wěn)，電流增大，并且保留時間也相應延長。因此，選擇SDS濃度為25 mmol·L－1。

3.3.3 有機添加劑的影響 試驗中比較了不含有機溶劑的緩沖體系，發(fā)現(xiàn)大黃素和蘆薈大黃素無法分離，其他分析物的峰形差，基線不穩(wěn)，出現(xiàn)一些雜峰，電流太高。在緩沖體系中加入少量的有機溶劑，可以改善分離度或分離選擇性，并使許多水難溶的樣品得以用毛細管電泳分離，因此筆者考察了乙腈、乙醇、甲醇等添加劑對分離的影響。發(fā)現(xiàn)加入乙腈后，基線變得平滑，但因為其介電常數(shù)小，電流減小，保留時間長，且柱效低，峰展寬嚴重，對分離情況的改善無幫助；將乙腈換成乙醇后，基線漂移，峰形變差；改用甲醇，因其介電常數(shù)小，電流減小，大黃素和蘆薈大黃素可以達到基線分離，其他各分析物的峰形好，時間窗口增大。但甲醇比例在0～5%時分離情況不佳，出于對分離和遷移時間的綜合考慮，選擇8%的甲醇。

3.3.4 磺丁基-β-CD的影響 當緩沖體系中未加磺丁基-β-CD時，只能將大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚5種成分分離，漢黃芩苷與漢黃芩素之間不能基線分離，且實際中藥樣品中的成分非常復雜，漢黃芩素因有其他未知成分的干擾而分離不佳。由于CD不僅是手性選擇劑，而且被廣泛用作膠束電動毛細管電泳的添加劑，CD的2個重要特性參數(shù)是環(huán)狀分子空腔直徑和疏水性。CD在分離中的作用之一是立體空間的選擇性。較小的溶質(zhì)分子可以進入CD的疏水性空腔內(nèi)部，較大的分子則受到限制，從而產(chǎn)生對溶質(zhì)分子大小的選擇性[14]。加入磺丁基-β-CD后，峰形變窄，分離效果好。筆者考察了磺丁基-β-CD濃度對分離情況的影響，發(fā)現(xiàn)當其濃度為4 mmol·L－1時，各分析物的分離度好，如濃度＞4 mmol·L－1則會使電流過大，繼而基線漂移，使分離情況變差。綜合考慮對分離和遷移時間的影響，本試驗最終選擇磺丁基-β-CD的濃度為4 mmol·L－1。

3.3.5 分離電壓的影響 在毛細管電泳中，提高分離電壓可以縮短分離時間，但是在高電壓下會由于焦耳熱的影響，使溶質(zhì)產(chǎn)生擴散現(xiàn)象，從而降低毛細管電泳的分離效率。本試驗考察了14.0～20.0 kV電壓對分離的影響，綜合考慮各影響因素，選擇最佳分離電壓為14 kV。

3.4 提取方法的選擇

曾采用甲醇超聲提取法[2]、乙醇超聲提取法[12]，最后發(fā)現(xiàn)用乙醇超聲處理1 h，濾過，水浴揮干乙醇，冷卻，殘渣加甲醇溶解的提取方法效果最好，能將待測物完全提取出來，而且操作簡便、易行，最后選用此法。

綜上所述，本方法專屬性強、結(jié)果準確可靠、重復性好，可用于三黃片的質(zhì)量控制。

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