朱小東 曾彩虹 陳惠萍

腎活檢病理診斷由光鏡、免疫熒光、電鏡三部分組成，電鏡技術對腎臟病的診斷及分類具有極其重要的作用。環(huán)氧樹脂Epon 812是目前腎活檢常規(guī)電鏡檢查中應用最廣泛的包埋樹脂，但聚合硬化時間長以致電鏡標本制作周期較長，影響臨床及時獲取電鏡觀察結果。有報道Eponate 12作為一種黏度低、滲透作用快、聚合時間短的電鏡包埋劑已應用于快速電鏡技術，本文擬探討低黏度包埋劑Eponate 12在腎活檢電鏡中的應用，旨在更好地提供腎活檢患者超微結構改變特點以滿足臨床診斷的需要。

材料與方法

標本來源 選取40例南京軍區(qū)南京總醫(yī)院全軍腎臟病研究所常規(guī)腎活檢電鏡標本，分為實驗組和對照組各20例，每組包括IgA腎病(IgAN)5例、膜性腎病(MN)5例、狼瘡性腎炎(LN)5例、局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)5例。

試劑及配制 Eponate 12 Resin Kit With DMP-30(Product No.18010 TED PELLA.ICN，USA)，Epon 812、甲基內(nèi)次甲基二甲酸酐(NMA)、十二烷基琥珀酸酐(DDSA)、25%戊二醛、2%四氧化鋨、醋酸鈾及檸檬酸鉛(均購置SPI.USA)?；旌习駝┡渲品椒?以配制50 ml左右為例，單位ml)，Eponate 12包埋劑采用“HARD”配方，即 Eponate 12∶DDSA∶NMA∶DMP-30比例為 25.7∶9.3∶16.5∶0.8;Epon 812 包埋劑采用夏季配方，即Epon 812∶DDSA∶NMA∶DMP-30 比例為 25∶6.2∶18.9∶0.8。

實驗方法

取材與固定 兩組標本取材與固定處理程序相同。具體步驟:(1)取材、前固定，鋒利刀片切取1 mm3的組織塊，用專用鑷子輕夾放入4℃預冷的3.75%戊二醛電鏡固定液中，放置4℃冰箱固定4h;(2)漂洗，0.1M PBS緩沖液漂洗15 min×3次;(3)后固定、漂洗，1%鋨酸4℃固定1h;雙蒸水漂洗5 min×3次。

脫水、浸透與包埋、聚合

實驗組 梯度乙醇脫水:50%乙醇10 min×1次，70%乙醇10 min×1次，90%乙醇10 min×1次，100%乙醇10 min×3次;浸透、包埋:環(huán)氧丙烷10 min×3次;Eponate 12混合包埋劑∶環(huán)氧丙烷比例為1∶1浸透1h，Eponate 12混合包埋劑浸透3h。

對照組 梯度丙酮脫水:30%丙酮15 min×1次，50%丙酮15 min×1次，70%丙酮15 min×1次，90%丙酮15 min×1次，100%丙酮10 min×3次;浸透、包埋:丙酮:Epon 812混合包埋劑比例為1∶1浸透1h，Epon 812混合包埋劑浸透3h。

聚合 腎組織標本轉移至膠囊后放置烤箱內(nèi)，兩種處理方法見表1。

表1 采用不同包埋劑處理腎活檢電鏡組織的比較

切片及染色 Leica EM超薄切片機1 μm半薄切片，1%甲苯胺藍染色1 min，光鏡定位腎小球及腎小管。超薄切片銀白色厚約60～70 nm，選擇干凈且覆膜完好的銅網(wǎng)撈片，觀察撈片有無褶皺、裂痕，待切片干燥后進行醋酸鈾、檸檬酸鉛常規(guī)雙染色，分別為20 mim和15 min，切片完全干燥后日立H7500型透射電子顯微鏡下觀察。

電鏡下觀察 電鏡觀察的內(nèi)容包括切片是否均勻完整，有無皺褶、震顫、變形;超薄切片的染色性能和圖像反差是否良好;組織、細胞超微結構是否保存良好，超微結構的完整性和清晰度，有無物質抽提和聚集。

結 果

腎活檢電鏡標本處理時間 實驗組腎活檢電鏡標本從脫水到完全聚合耗時約17.5h，與對照組Epon 812包埋方法相比時間縮短約48～60h，從而縮短整個腎活檢標本制樣周期(表2)。

表2 Eponate 12與Epon 812標本制樣耗時比較

超薄切片質量 實驗組Eponate 12包埋劑在60℃溫箱中12h達到完全聚合，對照組約60h完全聚合，實驗組包埋塊手工修塊時硬度和韌性較強，半薄切片平整、無擠壓，容易切出大面積半薄切片;超薄連續(xù)切片厚度均勻，切片完整，無空洞、無震顫;切片能經(jīng)受較長時間的電子束照射，不易被電子束轟擊損壞。

超微結構 實驗組和對照組腎組織超薄切片經(jīng)醋酸鈾、檸檬酸鉛常規(guī)雙染色后圖像反差良好，實驗組腎組織、細胞微細結構顯示清晰，亞細胞結構保存良好，腎小管微絨毛結構清晰。與對照組相比，實驗組超微結構圖像對比清晰，染色效果良好，細胞內(nèi)精細結構保存良好，膜性細胞器如線粒體、內(nèi)質網(wǎng)、高爾基體質膜保持完整，細胞核膜、線粒體雙層膜及嵴結構顯示清晰(圖1)。

電子致密物反差 我們觀察了LN、MN、IgAN患者的電子致密物沉積情況，實驗組LN-IV型腎小球內(nèi)皮下大量高密度的電子致密物顯示高反差，對照組電子致密物反差低于實驗組;實驗組MN腎小球基膜上皮側內(nèi)的電子致密物沉積部位以及與周邊的界限顯示清楚，密度不均一的電子透亮區(qū)較好地顯示電子致密物的吸收程度(圖2A、B)，IgAN系膜區(qū)密度增高的電子致密物沉積顯示清晰(圖2C、D)。實驗組電子致密物對比反差較強，顯示效果優(yōu)于對照組，較好地反映出LN、MN、IgAN電鏡下組織學特點。

圖1 Eponate 12包埋的腎組織超微結構(EM)

圖2 Eponate 12包埋的腎小球電子致密物(EM)

討 論

完整的腎活檢病理診斷包括光鏡、免疫熒光及電鏡診斷，然而，由于腎活檢組織電鏡需經(jīng)過固定、漂洗、脫水、浸透、包埋、切片、染色，整個標本處理過程細致、復雜，耗時冗長往往不能滿足臨床需要。

目前國內(nèi)較常使用的Epon 812包埋劑聚合時間長，組織從處理到染色整個過程大約需要5～7d，整個制片周期耗時較長，造成電鏡報告遠滯后于光鏡及免疫熒光，一些腎臟疾病診斷必須依賴電鏡如薄基膜腎病、Alport綜合征、Fabry病、致密物沉積病等，因此電鏡觀察滯后往往影響腎臟疾病的診斷和治療。

Eponate 12作為一種黏度低、滲透快、聚合時間短的電鏡包埋劑，在腎活檢電鏡樣品制備應用中，標本上午取材固定，下午完成脫水浸透，利用晚上12～16h的時間完成聚合，最快次日即可切片染色至鏡下觀察，制片過程縮短至2～3d內(nèi)完成，電鏡報告甚至可以和光鏡、免疫熒光報告同步發(fā)出，臨床醫(yī)師在患者出院前即可獲得電鏡病理診斷報告，這對腎臟疾病的診斷和治療具有重大意義。

Epon 812是電鏡技術上使用最廣泛的環(huán)氧樹脂類包埋劑，25℃時其黏度150～200 cPa，完全聚合時間需要 60h［2-6］，Eponate 12 作為 Epon 812 的替代包埋劑，其黏度為15～21 cPa［7］，我們的研究也發(fā)現(xiàn)其黏度低，配成混合包埋劑后，滲透組織中速度更快，包埋劑聚合時間短，包埋塊的切割性能、切片的染色反差及超微結構的保存與Epon 812幾乎相同，在電子致密物顯示方面更清晰，圖像反差更好，在膜性結構、電子致密物的觀察方面更具優(yōu)勢。

隨著電鏡技術的不斷發(fā)展，低黏度包埋劑在快速電鏡制樣技術中應用越來越廣，Em Bed 812、Polar Bed 812、Polv Bed 812、spurr、ponate 12 等都屬于低黏度包埋劑，其浸透好，經(jīng)得住電子束照射，整個包埋過程可在一天內(nèi)完成［8］，在其他種類眾多的環(huán)氧樹脂類包埋劑中，spurr樹脂(ERL 4206)黏度最低，僅為7.18cPa，混合后的包埋劑黏度也只有60cPa，聚合時間更短，70℃烤箱中8h完全聚合，因而在快速電鏡制樣技術應用較廣，但缺點是毒性大并具有致癌性［9］，限制了其在臨床上廣泛應用。Eponate 12的黏度介于Epon 812和spurr之間，在組織各成分中的浸透速度適中，較少出現(xiàn)因包埋塊聚合不均而造成染色不佳的問題，使其成為低黏度包埋劑中一種較好的選擇。同其他包埋劑一樣，Eponate 12配方有多種，固化劑NMA與DDSA的比例決定聚合塊的硬度，其比例可參照經(jīng)典的Luft公式計算［10］。聚合塊太硬或太軟均不利于修塊和切片，如配方不適合應及時調(diào)整，在實際工作時 Luft配方中“HARD”配制的包埋塊硬度和韌性適中，容易獲得銀白色的超薄切片，切片染色效果滿意，加速劑DMP-30的濃度應控制在1.5% ～2%之間，其用量會直接影響聚合時間，濃度增加雖然可以加快單體間的聚合反應，但混合后的包埋劑黏度增加不利于充分浸透，包埋塊在切片時表面容易出現(xiàn)空洞和顫痕，嚴重影響制片質量。在實際工作中腎組織包埋塊在純包埋劑浸透3h后直接放置60℃烤箱聚合過夜(12～16h)，硬度完全達到半薄和超薄切片的要求。此外商品化的Eponate 12試劑與Epon 812價格相差不大，并不增加標本前期處理成本，具有很好的經(jīng)濟性。

Eponate 12包埋劑在腎活檢電鏡樣品制備過程中取得較滿意的效果，特別是顯著縮短腎活檢病理電鏡標本制作時間，切片超微結構好和電子致密物反差明顯在電鏡的快速診斷方面，具有很大的實用價值。在腎活檢電鏡技術中，Eponate 12不失為Epon 812的理想替代包埋劑，能夠更好適應臨床診斷對電鏡技術的要求。

1 黎磊石，曾彩虹，劉志紅.腎活檢組織標本的制作.黎磊石，劉志紅.中國腎臟病學.北京:人民軍醫(yī)出版社，2008，P157-169.

2 宋田斌，湯 瑩，陸月良，等.電子顯微鏡生物樣品制備技術.楊勇驥.實用生物醫(yī)學電子顯微鏡技術.上海:第二軍醫(yī)大學出版社，2003，P85-86.

3 Finck H.Epoxy resins in electron microscopy.J Biophys Biochem Cytol，1960，7:27-30.

4 劉旭明，王 萍，唐新萍，等.快速電鏡制樣技術在診斷電鏡中的應用.臨床與實驗病理學雜志，1999，15(1):89.

5 Wyffels JT.Principles and Techniques of Electron Microscopy:Biological Applications，F(xiàn)ourth Edition，by M.A.Hayat.Microsc microanal，2001，7(1):66.

6 彭 玲，鄭 容，鄭妹穎，等.一種臨床實用的快速電鏡標本制備方法.電子顯微學報，2006，25(增刊):277-278.

7 Mascorro JA，Kirby GS.Designing multi-viscosity embedding media utilizing novel resin/anhydride/catalyst combinations.Microsc Res Tech，1992，20(1):105-106.

8 Dykstra MJ.Classes and characteristics of reigns.//Dykstra MJ，Reuss LE，eds.Biological electron microscopy:theory，techniques，and troubleshooting.2nd edition.Unite states of America，2003:P31-105.

9 Spehner D，Drillien R，Proamer F，et al.Embedding in Spurr's resin is a good choice for immunolabelling after freeze drying as shown with chemically unfixed dendritic cells.J Microsc，2002，207(Pt 1):1-4.

10 Luft JH.Improvements in epoxy resin embedding methods.J Biophys Biochem Cytol，1961，9:409-414.