潘建超* 薛東升 張文明

（上海凱寶藥業(yè)股份有限公司，上海 201401）

主要生物分子物質(zhì)含量測定和分析。

1 脂肪類物質(zhì)檢測

用高效薄層層析色譜法[1]，對樣品進行分析，然后分別用碘熏蒸法顯色和間苯二酚-鹽酸溶液顯色檢測樣品中中性脂和糖脂含量。

1.1 檢測方法

①層析板預(yù)處理：取硅膠G薄層板于130℃活化1h。②層析：取供試品用全自動點樣儀上樣，斑點直徑＜0.5cm，涼干，作4個上樣點，置展開缸中展開。展開劑為氯仿∶甲醇∶0.2%CaCl2（55∶45∶10）。③顯色：每兩個上樣點為一組，取一組硅膠板，用噴瓶噴灑間苯二酚-鹽酸溶液[取間苯二酚2g溶于蒸餾水100mL中，取10mL 2%間苯二酚水溶液加80mL 36%濃鹽酸（含0.25mL 0.1mol/L硫酸銅）加水定容到100mL，使用前4h配制]，噴后即加玻璃片封蓋，110℃顯色20min。取另一組硅膠板，置一個密閉玻璃容器內(nèi)，加入少量碘，稍微加熱使碘變?yōu)榈庹魵猓?min。

1.2 測定結(jié)果

用薄層色譜分析，樣品在兩組薄層板均無顯色條帶出現(xiàn)，說明樣品中不含中性脂肪類物質(zhì)和糖脂類物質(zhì)，而陽性對照品中性脂（大豆卵磷脂）和糖脂（單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂）皆出現(xiàn)明顯顯色條帶。

2 糖類物質(zhì)含量測定

用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法[2]和地衣酚法[3]對樣品進行總糖和核糖含量測定。

2.1 總糖含量測定

①葡萄糖溶液的制備：精密稱取葡萄糖約10.0mg，置10mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，混勻，精密吸取1mL置5mL量瓶中，加水至刻度，即為200μg/mL的葡萄糖溶液，臨用新制。②二硝基水楊酸（DNS）試劑配制：稱取DNS 1g，苯酚0.2g，亞硫酸鈉0.05g，氫氧化鈉1g，酒石酸鉀鈉20g，加水溶解并稀釋至100 mL即得。③樣品溶液：取原液用注射用水稀釋2倍即得。④測定法：取葡萄糖溶液、水和樣品溶液于10mL玻璃試管中，混勻，分別加入3mL的DNS試劑，置沸水浴中加熱15min，放冷，用水稀釋至10mL，搖勻，照分光光度法測定550nm處吸光度。⑤結(jié)果計算：用葡萄糖對照品溶液濃度對其相應(yīng)吸光度作直線回歸（R2應(yīng)≥0.99），由直線方程求出樣品溶液總糖含量。

2.2 核糖含量測定

①D-核糖溶液的制備：精密稱取D-核糖約10.0mg，置10mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，混勻，從中精密量取1mL，置5mL量瓶中，加水至刻度，即為200μg/mL的D-核糖溶液，臨用新制。②三氯化鐵-鹽酸溶液配制：稱取三氯化鐵（FeCl3·6H2O）0.5g，加濃鹽酸溶解成500mL，即得。③地衣酚試劑：取1g重結(jié)晶地衣酚用95%乙醇溶解定容至10mL即得。④樣品溶液：取原液用注射用水稀釋2倍即可。⑤測定法：取D-核糖溶液、水和樣品溶液于10mL玻璃試管中，混勻，分別加入1mL的三氯化鐵-鹽酸溶液，然后再加入0.1mL的地衣酚溶液，置沸水浴中加熱40min，放冷，用水稀釋至5mL，搖勻，照分光光度法測定670nm處吸光度。⑥結(jié)果計算：用核糖對照品溶液濃度對其相應(yīng)吸光度作直線回歸（R2≥0.99），由直線方程求出樣品溶液核糖含量。

2.3 測定結(jié)果

結(jié)果顯示，葡萄糖溶液和核糖溶液線形關(guān)系很好（圖1），R2＞0.99。根據(jù)測定結(jié)果帶入各自直線方程計算和乘以樣品稀釋倍數(shù)，樣品溶液中總糖含量為255.3μg/mL，核糖含量為198.0μg/mL。結(jié)果顯示樣品中核糖含量占總糖含量的77.55%，說明樣品糖類物質(zhì)主要以核糖為主。

圖1 抗結(jié)核特異性轉(zhuǎn)移因子原液糖類物質(zhì)測定標準曲線和直線方程

3 核酸檢測

用瓊脂糖平板法[4]測定樣品中核酸含量，用紫外掃描分析最大紫外吸收波長。

3.1 測定方法：①瓊脂糖核酸電泳：配制2%瓊脂糖平板，含0.5μg/mL的溴乙錠；取DNA標準和原液樣品，分別點樣10μL進行電泳，電泳后置紫光燈觀察和攝像。②紫外吸收波長掃描：取原液，用注射用水稀釋10倍后于200～400nm進行紫外吸收波長掃描分析。

3.2 結(jié)果

經(jīng)測定，DNA標準Ladder經(jīng)254nm紫光燈觀察顯色，但樣品無顯色，表明樣品中無雙鏈DNA或RNA檢出存在；樣品經(jīng)紫外掃描，最大紫外吸收波長為255.2nm，說明樣品中含核苷酸類物質(zhì)。綜合此兩個結(jié)果，樣品中含有低分子量寡核苷酸。

4 多肽檢測

分別用Lowry法[5]進行多肽含量測定和Tris-Tricine 凝膠電泳法[6]進行多肽分子量范圍分析。

4.1 測定方法

4.1.1 Lowry法多肽含量測定

①BSA溶液的制備：精密稱取BSA約10.0mg，置10mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，混勻，精密量取1mL，置10mL量瓶中，加水至刻度，即為100μg/mL的BSA溶液，臨用新制。②樣品溶液：取原液用水稀釋50倍即得。③測定法：取BSA溶液、水和樣品溶液于10mL試管中，混勻，分別按測定試劑盒加入各試劑，混勻，室溫放置30min后，照分光光度法測定650nm處吸光度。④結(jié)果計算：用BSA對照品溶液濃度對其相應(yīng)吸光度作直線回歸（R2≥0.99），由直線方程求出樣品溶液多肽含量。

4.1.2 Tris-Tricine 電泳法多肽分子量測定

按Tris-Tricine電泳法，取原液樣品進行電泳分析。上樣量為20μL，恒壓200V電泳。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍染色。

4.2 結(jié)果

結(jié)果顯示，BSA溶液線形關(guān)系很好（圖2），R2＞0.99。根據(jù)測定結(jié)果帶入直線方程計算，供試品溶液中多肽含量為93.96μg/mL，供試品系樣品稀釋50倍所得，故樣品中多肽含量為4.70mg/mL。同時Tris-Tricine電泳結(jié)果顯示，樣品在染色后凝膠上無顯色條帶，表明樣品在Tris-Tricine電泳上無多肽檢出。

圖2 抗結(jié)核特異性轉(zhuǎn)移因子原液多肽測定標準曲線和直線方程

5 抗結(jié)核特異性轉(zhuǎn)移因子原液生物分子物質(zhì)含量測定總結(jié)

本實驗對抗結(jié)核特異性轉(zhuǎn)移因子原液樣品（批號2010060110）進行一系列生物分子物質(zhì)含量測定，測定結(jié)果總結(jié)顯示，該樣品中未檢測出脂類物質(zhì)和雙鏈核酸，明顯檢出糖類物質(zhì)和多肽，其中糖類物質(zhì)以核糖為主，因此可以推斷本品主要物質(zhì)為含單鏈寡核苷酸和低分子量多肽的混合物[7]。

[1]Mtithing J.High-resolution thin-layer chromatography of gangliosides[J].J Chromatography A,1996,720(1/2):3-25

[2]Reese ET,Mandels M.Methods in carbohydrate chemistry[M]//.Whistler RL,ed.New York: Academic Press,1963:139.

[3]Mejbaum WZ.Ober die Bestimmung kleiner Pentosenmengen,insbesonder in Derivaten der Adenylsaiire[J]Physiol Chem,1939,258(1):117.

[4]盧圣棟,現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)[M].2版.北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,1999.

[5]Lowry OH.Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent[J].J Biol.Chem,1951,193(1):265-275.

[6]Schagger H,Van Jagoe G.Tricine-sodium dodecyl sulfate polyacrylamine gel electrophoresis for separation of protein in the range from 1 to 100 kDa[J].Anal Biochem,1987,166(2):368-373.

[7]中國生物制品規(guī)程2000版[S].2000.