王 婧，張 杰，張 穎，馬寧寧，謝良志

1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞工程中心，北京 100005

2神州細(xì)胞工程有限公司，北京 100176

骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (bone morphogenetic protein，BMP)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族的成員，是廣泛分布于動(dòng)物骨組織的酸性蛋白質(zhì)，在修復(fù)骨質(zhì)缺損和促進(jìn)骨折愈合、造血系統(tǒng)分化、神經(jīng)發(fā)育和修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用［1］。其中BMP-2誘導(dǎo)成骨的活性最強(qiáng)，是骨骼系統(tǒng)形成和正常發(fā)育所必不可少的因子。重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2的成熟肽 (recombinant human bone morphogenetic-2 mature peptide，rhBMP-2m)已經(jīng)被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于骨質(zhì)損傷、額面修復(fù)及脊椎融合，因此rhBMP-2m具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于rhBMP-2m及其單克隆抗體的生產(chǎn)一直受到工藝的限制不適合其推廣應(yīng)用，如復(fù)性困難、工藝難以放大等。本研究利用簡(jiǎn)單的原核表達(dá)系統(tǒng) (E.coli)獲得具有生物學(xué)活性的rhBMP-2m并制備能檢測(cè)真核細(xì)胞表達(dá)rhBMP-2m的單克隆抗體，為rhBMP-2m研究和商業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

材料 雌性Balb/c小鼠 (北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG(北京義翹神州生物技術(shù)有限公司);小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞MC3T3-E1(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心);SP瓊脂糖凝膠FF填料、反相層析 SOURCE30填料 (美國(guó) GE公司);Tris-HCl、NaCl、尿素、尼克酸等化學(xué)試劑 (上海生工生物工程有限公司);大腸桿菌菌株BL21(DE3)/pET24-rhBMP-2m、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的 pSTEP-rhBMP-2/293細(xì)胞株、轉(zhuǎn)染試劑盒 (北京義翹神州生物技術(shù)有限公司)。高壓均質(zhì)儀 (加拿大 ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司);7L磁力攪拌罐 (上海保興生物設(shè)備工程有限公司);高效高速冷凍離心機(jī)、臺(tái)式高速離心機(jī) (美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司)。

BL21(DE3)/pET24-rhBMP-2m發(fā)酵 取－70℃保存的BL21(DE3)/pET24-rhBMP-2m工程菌株，劃LB瓊脂平板，含30 mg/L卡那霉素，37℃培養(yǎng)20 h。挑取單菌落接種到2 ml MDG培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜。然后以2%接種量轉(zhuǎn)接到10 ml MDG中，培養(yǎng)8 h后，以此為種子接種到5L含有ZYM-5052培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，37℃，450 r/min攪拌，pH值7.0，培養(yǎng)過(guò)夜。收菌前取1 ml菌液，離心收集菌體細(xì)胞并超聲破碎，用13%還原SDS-PAGE檢測(cè)rhBMP-2m成熟肽的表達(dá)量及可溶性。在此以及之后的步驟中，所有SDSPAGE結(jié)果均使用BandScan軟件分析。

包涵體的分離、溶解、純化及復(fù)性 將培養(yǎng)過(guò)夜的菌液以6500 r/min，最小半徑119 mm，最大半徑222.8 mm，傾角20°，離心8 min，收集菌體，用細(xì)胞裂解液 (1 mmol/L EDTA、1%TritionX-100、1%Tween20、20 mmol/L Tris、pH 9.0)懸浮，高壓均質(zhì)儀破碎。破碎液以6500 r/min，最小半徑119 mm，最大半徑222.8 mm，傾角20°，離心40 min，棄去上清，收集沉淀，分離得到粗制包涵體。

粗制包涵體進(jìn)一步使用含有0.5 mol/L尿素的細(xì)胞裂解液洗滌第2次，6500 r/min，最小半徑119 mm，最大半徑222.8 mm，傾角20°，離心40 min收集沉淀。之后，包涵體用溶解緩沖液 (8 mol/L尿素、50 mmol/L Tris、pH8.0)溶解過(guò)夜，第2天13000 r/min，最小半徑25 mm，最大半徑97 mm，傾角25°，離心10 min，收集上清并使用0.22 μm醋酸纖維膜過(guò)濾。

變性后的rhBMP-2m使用陽(yáng)離子柱SP-Sepharose FF(1.6 cm×15 cm)分離純化。上樣前使用緩沖液A(8 mol/L尿素、50 mmol/L Tris、pH7.0)平衡，使用含有1 mol/L NaCl的緩沖液A線(xiàn)性洗脫，每10毫升體積收集一管洗脫液，待SDS-PAGE分析后合并純度較高的洗脫蛋白組分。洗脫組分通過(guò)直接稀釋到含有0.75 mol/L尼克酸復(fù)性緩沖液，去除變性劑達(dá)到復(fù)性效果［1］。復(fù)性后的蛋白樣品使用RPCSource30(1.1 cm×15 cm)分離純化，上樣前使用含有1‰三氟乙酸的去離子水平衡，使用同樣含有1‰三氟乙酸的乙腈線(xiàn)性洗脫。合并rhBMP-2m同源二聚體含量相當(dāng)組分，得到樣品Ⅰ和樣品Ⅱ。

重組人BMP-2成熟肽活性測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)［2］，小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞MC3T3-E1在rhBMP-2m刺激培養(yǎng)下向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，特征性產(chǎn)生堿性磷酸酶。本研究采用含有rhBMP-2m濃度分別為10000、5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.125、39.063、0 ng/ml的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞，通過(guò)測(cè)定每個(gè)培養(yǎng)條件下的堿性磷酸酶活性變化分析rhBMP-2m的生物學(xué)活性，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。

以每孔2×104個(gè)細(xì)胞/孔接種 MC3T3-E1于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在含有10%FBS α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，隨后換不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，之后換含有1%FBS的條件培養(yǎng)基 (即含有不同濃度rhBMP-2m)刺激培養(yǎng)72 h。最后，吸去培養(yǎng)上清，使用事先預(yù)冷的PBS洗板兩次，然后每孔中加入100 μl含有10 mmol/L對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽的裂解液，37℃反應(yīng)30 min，加入1 mol/L NaOH終止反應(yīng)，在405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品所吸收的光密度值。

重組BMP-2成熟肽單克隆抗體的制備 用復(fù)性純化得到的rhBMP-2m樣品Ⅰ免疫小鼠，單克隆抗體制備具體過(guò)程參照《細(xì)胞與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》第二章［3］。

免疫印跡鑒定 將復(fù)性純化得到的rhBMP-2m樣品Ⅰ進(jìn)行還原及非還原SDS-PAGE電泳，用半干轉(zhuǎn)方法將凝膠蛋白帶轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，5%牛血清蛋白封閉過(guò)夜，加入單克隆抗體，室溫2 h后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠 IgG，最后使用辣根過(guò)氧化物酶特異性底物DAB顯色。同樣的方法，使用pSTEP-rhBMP-2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞裂解液鑒定所獲得單克隆抗體的特異性。

結(jié) 果

rhBMP-2m的誘導(dǎo)表達(dá) 工程菌BL21(DE3)/pET24-rhBMP-2m進(jìn)行自誘導(dǎo)發(fā)酵，發(fā)酵液體積為5 L，收樣前取樣檢測(cè)其在600 nm處的光密度值為13。13% 還原SDS-PAGE電泳分析 (圖1)，誘導(dǎo)后全菌在相對(duì)分子質(zhì)量約13000處有一條高表達(dá)的蛋白條帶，約占全菌蛋白的40%，破菌后80%以上目的蛋白以不溶解的包涵體形式存在。

rhBMP-2m包涵體溶解、純化及復(fù)性結(jié)果 SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，在300～450 mmol/L NaCl間洗脫樣品純度達(dá)到90%(圖2)。取該樣品進(jìn)行稀釋復(fù)性，復(fù)性率達(dá)到75%，即在非還原SDS-PAGE中顯示復(fù)性后二聚體的含量占總蛋白量的75%。復(fù)性后樣品濃度小于0.1 mg/ml，純度約70%。

復(fù)性后樣品使用反相層析純化目的蛋白主要在30%～45%乙腈濃度下獲得。純化后獲得兩組樣品，樣品Ⅰ濃度為0.7 mg/ml，二聚體占蛋白總量的85%以上;樣品Ⅱ濃度為0.28 mg/ml，二聚體占蛋白總量的40%(圖3)。兩組樣品在還原性SDS-PAGE結(jié)果中顯示純度均大于95%。在其后的rhBMP-2m單克隆抗體制備及免疫印跡鑒定實(shí)驗(yàn)中所使用的樣品均為樣品Ⅰ。

圖1 rhBMP-2m誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性還原電泳分析Fig 1 Reduced SDS-PAGE analysis of rhBMP-2m induced expression and its dissolubility

圖2 變性rhBMP-2m陽(yáng)離子層析柱純化結(jié)果還原電泳分析Fig 2 Reduced SDS-PAGE analysis of denatured rhBMP-2m purified by cation exchange chromatography

rhBMP-2m活性鑒定結(jié)果 復(fù)性純化后獲得的rhBMP-2m樣品Ⅰ和Ⅱ在40～5000 ng/ml均表現(xiàn)出生物學(xué)活性，隨著rhBMP-2m的濃度增加，MC3T3-E1細(xì)胞產(chǎn)生的堿性磷酸酶活力呈對(duì)稱(chēng)S形曲線(xiàn)增長(zhǎng)。在相同rhBMP-2m濃度下，MC3T3細(xì)胞中樣品Ⅰ誘導(dǎo)產(chǎn)生的堿性磷酸酶活性比樣品Ⅱ誘導(dǎo)產(chǎn)生的堿性磷酸酶活性高 (圖4)。

圖4 誘導(dǎo)MC3T3-E1中堿性磷酸酶活性鑒定樣品Ⅰ和Ⅱ的生物學(xué)活性Fig 4 Biologic activities of samplesⅠandⅡ were measured by the induction of alkaline phosphatase activity in MC3T3-E1 cells

單克隆抗體的獲得及鑒定 共篩選得到2株rh-BMP-2m單克隆抗體，分別命名為MM01H和MM03H。采用rhBMP-2m樣品Ⅰ進(jìn)行免疫印跡分析，還原SDS-PAGE條件下免疫印跡結(jié)果顯示MM01H和MM03H均在相對(duì)分子質(zhì)量13000處雜交出特異性條帶，相對(duì)分子質(zhì)量與rhBMP-2m單體相符合;非還原SDS-PAGE條件下免疫印跡結(jié)果顯示MM01H和MM03H均在相對(duì)分子質(zhì)量26000處雜交出特異性條帶，相對(duì)分子質(zhì)量與rhBMP-2m二聚體相符合(圖 5)。

圖5 免疫印跡分析MM01H單抗和MM03H單抗對(duì)抗原的識(shí)別Fig 5 Western blot of antigen using MM01H antiboy and MM03H antibody

采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 (轉(zhuǎn)入pSTEP-rhBMP-2質(zhì)粒)的293細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果顯示兩株單克隆抗體在相對(duì)分子質(zhì)量50000～55000雜交出清晰的條帶，相對(duì)分子質(zhì)量與糖基化的全長(zhǎng)rhBMP-2(396aa)單體相符合。其中單克隆抗體MM03H免疫印跡結(jié)果顯示在相對(duì)分子質(zhì)量18000附近出現(xiàn)雜交條帶，相對(duì)分子質(zhì)量與糖基化修飾的rhBMP-2成熟肽單體相符合 (圖6)。

圖6 免疫印跡分析MM01H單抗和MM03H單抗對(duì)表達(dá)人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2全長(zhǎng)基因的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞裂解液的識(shí)別Fig 6 Western blot of expressing total gene of human morphogenetic protein-2 transient transfection 293 cells lysate using MM01H and MM03H

討 論

人BMP-2的cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)1188bp，編碼396個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量約45000，基因定位于染色體20p-12。經(jīng)翻譯形成前體蛋白，酶切去氨基端的信號(hào)肽、前肽后，得到由114個(gè)氨基酸組成的成熟肽，相對(duì)分子質(zhì)量約13000。人BMP-2成熟肽包括7個(gè)半胱氨酸，其中6個(gè)形成分子內(nèi)二硫鍵，1個(gè)形成分子間二硫鍵，成熟肽的同源或異源二聚體BMP-2才具有生物活性［1］。使用Vector NTI Suite9軟件分析其結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示rhBMP-2m具有較強(qiáng)的疏水性。本研究用E.coli工程菌株表達(dá)出人BMP-2成熟肽段 (rh-BMP-2m)，80%目的蛋白以包涵體形式存在，表明rhBMP-2m包涵體經(jīng)復(fù)性形成具有生物學(xué)活性的rh-BMP-2m二聚體非常困難。相對(duì)真核表達(dá)系統(tǒng)，原核表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、目標(biāo)基因表達(dá)水平高、培養(yǎng)周期短等特點(diǎn)。因此，在解決蛋白復(fù)性的基礎(chǔ)上，原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)生產(chǎn)rhBMP-2m是能夠?qū)⒅委熜詒hBMP-2m推向臨床應(yīng)用的良好途徑。

第四軍醫(yī)大學(xué)陳蘇民課題組［4］采用透析法復(fù)性，雖然復(fù)性過(guò)程中目的蛋白濃度可以達(dá)到6 mg/ml，但是其中只有1/3的目的蛋白形成rhBMP-2m二聚體，且該課題組得到的rhBMP-2m細(xì)胞生物學(xué)活性的最低濃度僅為2μg/ml。同時(shí)，采用透析法復(fù)性在工藝放大時(shí)有一定的局限性。Yano等［5］和 Long等［6］的研究顯示具有生物學(xué)活性的rhBMP-2m最低濃度為30～50 ng/ml。但是文獻(xiàn) ［5-6］中提供的復(fù)性方法具有相同的缺點(diǎn)，即復(fù)性過(guò)程復(fù)雜 (一般在稀釋復(fù)性后還需要經(jīng)過(guò)至少兩步換液)、最終樣品濃度極低 (＜20μg/ml)、穩(wěn)定性差 (在濃縮過(guò)程中容易沉淀)。

本研究采用簡(jiǎn)單的稀釋復(fù)性法獲得了具有生物學(xué)活性的rhBMP-2m，雖然rhBMP-2m在復(fù)性后純度有所減低，分析原因可能是復(fù)性過(guò)程中一些錯(cuò)誤折疊使rhBMP-2m有不同的構(gòu)象。復(fù)性后樣品經(jīng)一步純化即可得到高純度和高濃度rhBMP-2m蛋白樣品。其中rhBMP-2m二聚體占總蛋白量85%以上的樣品Ⅰ在40 ng/ml時(shí)即表現(xiàn)出生物學(xué)活性，復(fù)性后樣品中正確折疊的二聚體含量與蛋白生物學(xué)活性密切相關(guān)。本研究采用的工藝，復(fù)性緩沖液成分簡(jiǎn)單、純化成本低、穩(wěn)定性好，成功解決了復(fù)性困難、復(fù)性后樣品難濃縮等難題，容易放大到規(guī)?；a(chǎn)。

關(guān)于rhBMP-2m的單克隆抗體制備目前報(bào)道較少，分析原因可能為免疫的抗原難以制備，同時(shí)BMP-2m各物種間高度保守，免疫原性弱，只有輕微的免疫刺激能力［7］。本研究通過(guò)原核表達(dá) (E.coli)，復(fù)性獲得具有生物學(xué)活性的rhBMP-2m作為抗原免疫小鼠，并用于抗體篩選，最終獲得兩株結(jié)合力強(qiáng)、特異性良好的單克隆抗體 (圖5)。獲得的單克隆抗體可用于建立rhBMP-2m的檢測(cè)方法，用于檢測(cè)其他表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)量，篩選高表達(dá)的細(xì)胞株。

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 (轉(zhuǎn)入pSTEP-rhBMP-2質(zhì)粒)的293細(xì)胞裂解液免疫印跡顯示，rhBMP-2在前體蛋白顯色位置在相對(duì)分子質(zhì)量為50000～55000，比理論相對(duì)分子質(zhì)量45000高，是由于rhBMP-2前體蛋白被糖基化，即糖基化發(fā)生在其剪切成為成熟肽之前。筆者推測(cè)，這種糖基化可能發(fā)揮穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的作用，對(duì)rhBMP-2m向細(xì)胞外分泌及活性具有重要的意義。

綜上，本研究的重要意義是:(1)為今后建立E.coli表達(dá)rhBMP-2m規(guī)?；a(chǎn)工藝奠定基礎(chǔ);(2)獲得具有結(jié)合力強(qiáng)、特異性好的單克隆抗體，為進(jìn)一步研究生理?xiàng)l件下BMP-2相關(guān)疾病的發(fā)生提供檢測(cè)方法;(3)建立抗體檢測(cè)方法，為rhBMP-2m在其他表達(dá)體系中的研究提供監(jiān)測(cè)手段。

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