趙 晉 周志華 李 敏

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350108)

引言

人工血管和自體血管是目前臨床上小直徑血管移植物的主要來源。在實(shí)踐中，人工血管存在植入后容易引起血栓形成、內(nèi)膜增生、遠(yuǎn)期通暢率不高等問題;自體血管受到來源、大小等限制，還無法滿足小直徑血管移植物的要求[1-2]。組織工程為小直徑血管移植物的來源提供了有效途徑，制備可支持細(xì)胞進(jìn)行生命活動的支架是組織工程血管研究的重要領(lǐng)域。近年來，組織工程血管支架領(lǐng)域研究的重點(diǎn)是將不同材料共混構(gòu)成復(fù)合材料，如膠原/聚己內(nèi)酯(PCL)[3]、絲素蛋白/聚對二氧雜環(huán)己酮(PDO)[4]、膠原/彈性蛋白/聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)[5]，以同時發(fā)揮各材料的優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)可制備具有高孔隙率和比表面積的小直徑管狀支架，其納米纖維可模擬細(xì)胞外基質(zhì)的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，利于細(xì)胞的粘附、生長及增殖。生物活性分子RGD短肽(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)介導(dǎo)種子細(xì)胞與支架材料粘附，能夠促進(jìn)細(xì)胞的粘附和分化[6]。

前期根據(jù)蜘蛛絲結(jié)構(gòu)及功能特性，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建并表達(dá)了RGD-重組蛛絲蛋白(命名為pNSR32)[7]，并將 RGD-重組蛛絲蛋白與力學(xué)性能優(yōu)良的PCL、血液相容性良好的殼聚糖(CS)共混，應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)制備pNSR32/PCL/CS復(fù)合納米纖維小直徑血管支架。實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到所制備的小直徑血管支架具有良好的血液相容性，適當(dāng)?shù)牧W(xué)性能，其三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)模擬了細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)[8]。在此基礎(chǔ)上，本研究應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)法，通過分析pNSR32/PCL/CS復(fù)合納米纖維小直徑血管支架浸提液毒性，觀察種植在支架材料上體外培養(yǎng)的SD大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(簡寫為SDRAEC)粘附和增殖情況，結(jié)合細(xì)胞毒性MTT比色法和細(xì)胞免疫熒光染色方法，檢測細(xì)胞生物學(xué)特性。通過評價支架的細(xì)胞相容性，分析該復(fù)合材料作為小直徑血管組織工程支架的可行性，也為進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與設(shè)備

JSM-7500 F型冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本電子株式會社)、ELx 800型酶標(biāo)儀(Bio-tek instrument，美國)、HEARACell 150 i型 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific，美國)、SW-CJ-2D型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、BX51熒光顯微鏡(OLYMPUS，日本)、靜電紡絲儀(自組裝[9])，聚己內(nèi)酯(PCL)(MW=80000，日本大賽潞化學(xué)公司)、殼聚糖(CS)(脫乙酰度91.18%，浙江玉環(huán)縣海洋生物化學(xué)有限公司)、RGD-重組蛛絲蛋白(pNSR32)(相對分子貨量 102KD，自制[10])、DMEM 高糖培養(yǎng)基(Gibco，美國)、胎牛血清(HyClone，美國)、青鏈霉素(HyClone，美國)、胰蛋白酶(Amresco，美國)、亞甲基亞砜(DMSO)(Sigma，美國)、四氮唑鹽(MTT)(Sigma，美國)、兔抗鼠約為 DWF抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、兔抗鼠CD31抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch Laboratories，美國)、Triton X-100(Genview，美國)、其他試劑均選用分析純。

1.2 方法

1.2.1 pNSR32/PCL/CS復(fù)合納米纖維支架的制備

在前期的報道中，已詳細(xì)描述過PCL、pNSR32/PCL、p NSR32/PCL/CS復(fù)合納米纖維支架的制備方法[8]?，F(xiàn)簡述如下：以甲酸為溶劑(電紡液濃度0.25 g/mL)，制備 PCL 電紡液、m(pNSR32)：m(PCL)為5：95的 p NSR32/PCL混合電紡溶液，以及m(pNSR32)：m(PCL)：m(CS)為 5：85：10 的pNSR32/PCL/CS混合電紡液。采用可轉(zhuǎn)動軸柄作為接收器，通過靜電紡絲技術(shù)制備所需的納米纖維支架。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SDRAEC由SD大鼠胸主動脈組織貼塊法獲得，細(xì)胞免疫熒光法鑒定。選擇含15%胎牛血清(FBS)的 DMEM高糖培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)所用的內(nèi)皮細(xì)胞為第3～5代。

1.2.3 體外浸提液毒性試驗(yàn)[11]

1.2.3.1 浸提液的制備

根據(jù) ISO10993-12：2009，分別取 PCL、pNSR32/PCL及 pNSR32/PCL/CS納米纖維支架，按0.1 g/mL比例加入DMEM培養(yǎng)液，37℃浸提24 h，過濾除菌，4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 體外浸提液毒性評價

SDRAEC按一定濃度接種于96孔板，培養(yǎng)1 d后棄培養(yǎng)液，加100 μL支架浸提液繼續(xù)培養(yǎng)。每種浸提液設(shè)4孔，以單純培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞作為陰性對照組。于培養(yǎng)1、3、5、7 d后行 MTT比色法檢測，檢測波長570 nm，參比波長630 nm，根據(jù)吸光值繪制細(xì)胞生長曲線，并按以下公式計算細(xì)胞相對增殖度(relative growth rate，RGR)。RGR=(樣品組吸光值A(chǔ)/陰性對照組吸光值 A)×100%。根據(jù)細(xì)胞RGR參考評價標(biāo)準(zhǔn)[12]，對支架材料的細(xì)胞毒性進(jìn)行分級。

1.2.4 SDRAEC粘附率的測定

將一定大小體積的 PCL、pNSR32/PCL及pNSR32/PCL/CS納米纖維支架置于24孔板中，設(shè)3個復(fù)孔，另設(shè)細(xì)胞培養(yǎng)板(TCP)和蓋玻片(coverslip)分別為陰性、陽性對照組。SDRAEC按一定濃度接種，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別于4、8 h MTT比色法檢測，檢測波長570 nm，參比波長630 nm，按以下公式計算初期粘附率。初期粘附率=實(shí)驗(yàn)組吸光值A(chǔ)/陰性對照組吸光值A(chǔ)×100%。

1.2.5 SDRAEC增殖力的測定

將一定大小體積的 PCL、pNSR32/PCL及pNSR32/PCL/CS納米纖維支架置于24孔板中，設(shè)3個復(fù)孔，另設(shè)蓋玻片(coverslip)為陽性對照組。SDRAEC按一定濃度接種，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別于1、3、5、7 d MTT比色法檢測，檢測波長570 nm，參比波長630 nm，繪制細(xì)胞在不同材料上的增殖曲線。

1.2.6 SDRAEC表型表達(dá)的檢測

將一定大小體積的pNSR32/PCL/CS納米纖維支架置于24孔板中，SDRAEC按一定濃度接種，5 d后免疫熒光染色。免疫熒光染色步驟簡述如下：棄培養(yǎng)液，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定;PBS洗滌，加入0.1%Triton X-100處理;PBS洗滌，5%山羊血清封閉1 h;PBS洗滌，分別加入一抗(兔抗鼠 CD31、vWF因子 1∶100)，4℃ 孵育過夜;PBS洗滌，加入FITC標(biāo)記的羊抗兔 IgG二抗(1∶50)，37℃孵育30 min，DAPI復(fù)染細(xì)胞核。熒光顯微鏡觀察，拍照。

1.2.7 統(tǒng)計分析

運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示;應(yīng)用方差分析法，P＜0.05為差異具統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 浸提液毒性試驗(yàn)

細(xì)胞分別用 PCL、pNSR32/PCL和 pNSR32/PCL/CS材料浸提液培養(yǎng)，與陰性對照組類似，細(xì)胞保持正常形態(tài)，折光性強(qiáng)，貼壁、增殖良好。表1為MTT比色法測定 PCL、p NSR32/PCL和 pNSR32/PCL/CS支架材料浸提液毒性的結(jié)果。

結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，各組細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，不同時間點(diǎn)吸光值有顯著差異(P ＜0.05)。組間相比較，PCL組7 d、p NSR32/PCL組1、3、5 d、pNSR32/PCL/CS 組 1、3 d 的吸光值與對照組相比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 MTT法檢測不同支架材料浸提液毒性(A=OD570nm－OD630nm，x±S)Tab.1 Cytotoxicity test of extracts with various materials by MTT

細(xì)胞在各支架材料浸提液中的細(xì)胞生長曲線見圖1。各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的生長趨勢均與對照組類似，1～3 d細(xì)胞生長緩慢，3～5 d細(xì)胞呈指數(shù)生長，5～7 d細(xì)胞生長又趨于緩慢，顯示細(xì)胞生長狀態(tài)良好。從細(xì)胞生長曲線分析pNSR32/PCL/CS、pNSR32/PCL組細(xì)胞未受抑制，但 PCL組略受影響。

細(xì)胞相對增殖度與毒性等級評價見表2。用RGR對細(xì)胞毒性進(jìn)行分析，各支架材料毒級均低于1級，說明各材料浸提液均不顯示細(xì)胞毒性，適合細(xì)胞生長，符合組織工程支架材料的應(yīng)用要求。

表2 不同支架材料浸提液的細(xì)胞相對增殖度與毒性等級評價Tab.2 The RGR and cytotoxicity test of extracts with various materials

2.2 細(xì)胞粘附情況

除了評價支架材料的細(xì)胞毒性，細(xì)胞與支架材料間作用最重要的方面是細(xì)胞粘附[13]。MTT法檢測細(xì)胞粘附的結(jié)果如圖2和表3所示。

圖2所示為在考察的4 h內(nèi)，SDRAEC可粘附到各實(shí)驗(yàn)組材料及對照組上。隨培養(yǎng)時間延長，各組細(xì)胞粘附量均有所增加，其中 pNSR32/PCL及pNSR32/PCL/CS組4 h吸光值與8 h相比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。組間比較，4 h時 p NSR32/PCL/CS、pNSR32/PCL組及 TCP組細(xì)胞粘附量較多，PCL組及載玻片組粘附量較少。8 h時，pNSR32/PCL/CS、pNSR32/PCL組吸光值仍大于其他各組，與蓋玻片組相比差異顯著(P＜0.05)，與TCP組無顯著性差異(P＞0.05)。在考察時間內(nèi)，作為陽性對照組的蓋玻片組吸光值在各時間點(diǎn)均小于其他組，說明其細(xì)胞粘附能力較低。從表3中也可看出，無論4 h還是8 h，SDRAEC在 pNSR32/PCL/CS支架上的粘附率均超過100%，說明SDRAEC在該支架材料表面粘附性良好。

圖2 SDRAEC在不同支架材料上的粘附趨勢圖(A=OD570nm－OD630nm)Fig.2 SDRAEC adhesion on various materials

表3 SDRAEC在不同支架材料上的粘附率Tab.3 The rate of SDRAEC adhesion on various materials

2.3 細(xì)胞增殖情況

表4為MTT法測定SDRAEC增殖活力的結(jié)果。在培養(yǎng)的7 d內(nèi)，隨時間延長，各組細(xì)胞數(shù)量都有所增加：7 d＞5 d＞3 d＞1 d。在各檢測時間點(diǎn)，含有RGD蛛絲蛋白的 pNSR32/PCL/CS及pNSR32/PCL組與PCL及陽性對照組相比，細(xì)胞增殖活力差異顯著(P＜0.05)，RGD蛛絲蛋白的添加明顯促進(jìn)了細(xì)胞增殖;含有殼聚糖的 pNSR32/PCL/CS組吸光值大于 p NSR32/PCL組，3、5、7 d吸光值差異顯著(P＜0.05)，提示其細(xì)胞活性在實(shí)驗(yàn)組中最好，細(xì)胞代謝活力較高，說明殼聚糖對SDRAEC增殖有較好的支持作用。整體觀之，3種支架材料對SDRAEC增殖能力的促進(jìn)作用依次為pNSR32/PCL/CS＞pNSR32/PCL＞PCL。

表4 SDRAEC在不同支架材料上的增殖狀況(A=OD570nm－OD630nm，x±S)Tab.4 SDRAEC proliferation on various materials

圖3所示是SDRAEC在各支架材料上的增殖曲線，細(xì)胞增殖速率及生長曲線形狀因復(fù)合培養(yǎng)材料不同而異，但基本符合SDRAEC生長曲線。從第3 d起，p NSR32/PCL/CS及 p NSR32/PCL組細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，生長速率較快，生長曲線在該時段更為陡峭;5 d后，pNSR32/PCL/CS及 pNSR32/PCL支架材料上細(xì)胞生長速率降低，進(jìn)入平緩期。同時，在平緩期又以 pNSR32/PCL/CS材料上的細(xì)胞數(shù)量居多，這說明 pNSR32/PCL/CS支架材料較適合內(nèi)皮細(xì)胞增殖。

圖3 SDRAEC在不同支架材料上的增殖曲線(A=OD570nm－OD630nm)Fig.3 SDRAEC proliferation curve on various materials

2.4 SDRAEC表型表達(dá)

如圖4所示，熒光顯微鏡下觀察到與p NSR32/PCL/CS支架共培養(yǎng)5 d的SDRAEC強(qiáng)烈表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物-vWF、CD31因子定位于細(xì)胞漿，可見其細(xì)胞生物學(xué)特性未受影響。

3 討論

材料對宿主細(xì)胞生長的影響即細(xì)胞相容性，一直是評價支架材料生物相容性的關(guān)鍵指標(biāo)之一[14]。為了評價本研究所制備的pNSR32/PCL/CS復(fù)合納米纖維的細(xì)胞相容性，本研究選擇體外細(xì)胞培養(yǎng)法，該法是醫(yī)療器械生物學(xué)安全性評價標(biāo)準(zhǔn)ISO10993中的規(guī)定項目，是生物材料進(jìn)入臨床前的必要評價[15]。通過材料與細(xì)胞體外復(fù)合培養(yǎng)，可直接觀察細(xì)胞生長情況，利于對細(xì)胞與材料相互作用的了解，有助于組織工程支架材料的篩選[16]。實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測了材料浸提液細(xì)胞毒性、細(xì)胞粘附及增殖狀況，并通過免疫熒光染色法分析細(xì)胞表型表達(dá)，從而評價該材料是否適合SDRAEC粘附、生長、增殖和功能發(fā)揮。

圖4 與pNSR32/PCL/CS支架共培養(yǎng)5 d的SDRAEC表型表達(dá)。(a)vWF;(b)CD31(200×)Fig.4 Phenotypic expression of SDRAEC on pNSR32/PCL/CS scaffolds at 5 days after cell seeding.(a)vWF;(b)CD31(200×)

ISO10993中推薦的四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法以其簡便迅速、敏感性強(qiáng)等特點(diǎn)在檢測細(xì)胞毒性方面得到廣泛應(yīng)用。同時，本實(shí)驗(yàn)中采用內(nèi)皮細(xì)胞用于細(xì)胞毒性試驗(yàn)，增加了材料毒性評價的敏感性，材料浸提液或材料與其特定植入部位的靶細(xì)胞(內(nèi)皮細(xì)胞)相互作用，反映材料細(xì)胞毒性的同時還能反映材料對細(xì)胞增殖、分化等功能的影響[17]。結(jié)果顯示pNSR32/PCL/CS浸提液對SDRAEC形態(tài)無明顯影響，對細(xì)胞增殖無明顯抑制作用，細(xì)胞毒性分級為0級，符合ISO10993中對體內(nèi)植入材料的要求，表明這種材料無明顯細(xì)胞毒性[18]，為進(jìn)一步進(jìn)行動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

細(xì)胞與支架材料的相互作用是組織工程研究的重要領(lǐng)域，相互作用的第一階段正是細(xì)胞在材料上的粘附與鋪展，而細(xì)胞增殖是相互作用初期的生物學(xué)行為之一。細(xì)胞粘附的差異將影響細(xì)胞的增殖、分化等功能，細(xì)胞增殖作為細(xì)胞粘附鋪展與功能分化的中間紐帶，會給材料與機(jī)體結(jié)合的長期效果帶來十分巨大的影響[19]。細(xì)胞在材料表面的粘附、增殖差異是由生物材料的多種性質(zhì)決定的，如材料表面形態(tài)、化學(xué)狀態(tài)和元素組成等[20]。本研究中pNSR32所含RGD短肽是細(xì)胞粘附增殖的關(guān)鍵，其序列可被固有粘附蛋白受體特異性結(jié)合，在材料表面自發(fā)形成分子層，從而為種子細(xì)胞提供特異性位點(diǎn)，促進(jìn)細(xì)胞粘附和分化[1]。同時殼聚糖帶正電荷，有利于帶負(fù)電荷的細(xì)胞吸附。此外，羧基、羥基、表面親水性氨基以及多孔支架與細(xì)胞間的相互作用也是促進(jìn)細(xì)胞粘附增殖的可能機(jī)理[21]。Healy等采用多種肽類活性因子修飾生物材料表面時發(fā)現(xiàn)，能夠促進(jìn)細(xì)胞粘附的修飾方法往往也會促進(jìn)細(xì)胞在材料表面的增殖[22]。Liu等在研究由生物活性因子GRGDS五肽所修飾的聚(L-丙交酯-β-蘋果酸)對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的作用時，也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果[23]。本研究基于靜電紡絲技術(shù)制備的 p NSR32/PCL/CS復(fù)合納米纖維支架也能夠支持SDRAEC在材料表面粘附，有效地促進(jìn)其增殖，保持血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長規(guī)律。

內(nèi)皮細(xì)胞能合成與代謝多種激素和血管活性物質(zhì)，如血管性假血友病因子(von Willebrand Factor，vWF)、血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule，PECAM-1C D31)、前列腺素等[24-26]。其中 vWF為內(nèi)皮細(xì)胞合成的依賴性因子之一，主要生理功能有介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞粘附、遷移;攜帶凝血因子Ⅷ，促進(jìn)其合成和分泌，保護(hù)其免受滅活;調(diào)節(jié)血小板粘附、聚集等[24]。CD31與Ca2+依賴性粘附分子共同構(gòu)成內(nèi)皮細(xì)胞的粘附連接，是血管內(nèi)皮細(xì)胞層通透屏障的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，同時CD31還介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞運(yùn)動，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管新生[25-26]。本研究應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光法，試圖從細(xì)胞功能發(fā)揮方面評價材料的細(xì)胞相容性。試驗(yàn)中vWF、CD31因子的陽性表達(dá)說明其生物學(xué)特性未受影響。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示的細(xì)胞形態(tài)及覆蓋范圍，說明該電紡支架具備粘附內(nèi)皮細(xì)胞的能力，能為內(nèi)皮重建提供一個適宜的生理生化環(huán)境。

4 結(jié)論

1)添加RGD-重組蛛絲蛋白及殼聚糖能夠促進(jìn)SDRAEC在材料表面的增殖，對組織工程中改善材料表面生物相容性及生物活性提供了新的思路和方法。

2)pNSR32/PCL/CS復(fù)合納米纖維小直徑血管支架對SDRAEC的生長無明顯毒性，具有良好的細(xì)胞相容性，能夠支持SDRAEC在材料表面粘附、增殖，保持表型表達(dá)，為該支架的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供了生物學(xué)依據(jù)。

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