張濤 陳磊 張怡靚 李楚彥 陳仁義

星形膠質(zhì)細(xì)胞活化會(huì)釋放某些炎癥因子及細(xì)胞因子與神經(jīng)元相應(yīng)受體結(jié)合，增強(qiáng)神經(jīng)元興奮性[1]，從而在神經(jīng)病理性痛中發(fā)揮重要作用[2]。炎性痛與神經(jīng)病理性痛具有不同的發(fā)病機(jī)制[3]，因此本實(shí)驗(yàn)以完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant，CFA)誘導(dǎo)炎性痛動(dòng)物模型，觀察脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞在CFA致痛模型中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料220～250 g雄性SD大鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要儀器和試劑機(jī)械痛敏測(cè)試儀(North Coast公司);熱痛敏測(cè)試儀(西安博邦化工有限公司);Real-time PCR反應(yīng)體系及水平電泳槽(Bio-Rad公司);膠原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)PCR引物(正義鏈:5'-AGAGGGACTTCCATCCACTG-3'反義鏈:5'-GGTTGTGGACTCTTCCAGGT-3'南京金斯瑞生物科技有限公司);CFA，L-α-aminoadipate(LAA)及Real-time PCR試劑盒(Sigma公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥SD大鼠隨機(jī)分為3組(n=6/組):CFA組(以60 mg/kg劑量腹腔注射4%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，于左下肢足底注射100 μl CFA誘導(dǎo)炎性痛模型，同時(shí)參照文獻(xiàn)[3]行鞘內(nèi)置管術(shù)，術(shù)后6 d鞘內(nèi)給予生理鹽水10 μl);LAA組(處理方式同CFA組，但鞘內(nèi)給予LAA溶液10 μl);對(duì)照組(處理方式同CFA組，但足底及鞘內(nèi)均給予生理鹽水)。LAA藥物配置:以生理鹽水配制，濃度為100 nmol/10 μl。

1.4 疼痛閾值的檢測(cè)參照文獻(xiàn)所述方法[2]，于術(shù)前2 d及術(shù)后7 d運(yùn)用von Frey絲檢測(cè)大鼠左后肢足底機(jī)械性痛域，運(yùn)用Hargreaves熱輻射法檢測(cè)大鼠左后肢足底熱痛閾。

1.5 Real-time PCR檢測(cè)大鼠脊髓背角GFAP mRNA變化行為學(xué)測(cè)試之后，腹腔注射4%戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠(60 mg/kg)，剝離脊髓腰膨大，分離腹背側(cè)，參照文獻(xiàn)[4]反轉(zhuǎn)錄脊髓背角GFAP mRNA，利用公式2-deltadeltaCt分析數(shù)據(jù)結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS 17.0軟件行單因素方差分析LSD檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鞘內(nèi)注射LAA可緩解CFA大鼠左后肢足底炎性痛術(shù)前2 d各組左后肢足底熱痛閾及機(jī)械痛域無(wú)明顯差別(P＞0.05)。術(shù)后7 d，CFA組左后肢足底機(jī)械痛及熱痛閾值較對(duì)照組明顯降低(P＜0.01)，出現(xiàn)了明顯的炎性痛表現(xiàn);鞘內(nèi)注射LAA可緩解CFA大鼠左后肢足底炎性痛，LAA組左后肢足底機(jī)械痛及熱痛閾值較CFA組明顯升高(P＜0.01)(表1，表2)。

表1 各組大鼠左后肢足底機(jī)械痛閾值

表2 各組大鼠左后肢足底熱痛閾值(S)

2.2 鞘內(nèi)注射LAA抑制CFA大鼠脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞活化GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞活性標(biāo)志物。Real-time PCR檢測(cè)顯示，CFA組大鼠脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯活化，GFAP mRNA較對(duì)照組升高15.1%(P＜0.01)。鞘內(nèi)注射LAA可抑制CFA大鼠脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，LAA組GFAP mRNA較CFA組下降16.2%(P＜0.01)(圖1)。

圖1 鞘內(nèi)置管7 d各組大鼠脊髓背角GFAP mRNA。＊＊與對(duì)照組相比，P＜0.01;##與CFA組相比，P＜0.01

3 討論

傳統(tǒng)理論認(rèn)為，神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能異常導(dǎo)致了痛覺(jué)的產(chǎn)生和持續(xù)，關(guān)于炎性痛的發(fā)病機(jī)制及治療研究也一直圍繞著神經(jīng)元進(jìn)行，但最近有研究表明，膠質(zhì)細(xì)胞可能參與了神經(jīng)病理性痛的產(chǎn)生與維持[2]，這為神經(jīng)病理性痛提出了新的研究方向，也為炎性痛提供了新的研究思路。炎性痛與神經(jīng)病理性痛發(fā)病機(jī)制不同[3]，本研究以CFA誘導(dǎo)的炎性痛大鼠為研究對(duì)象，觀察了該模型7 d痛覺(jué)閾值及脊髓背角GFAP(星形膠質(zhì)細(xì)胞活性標(biāo)志物)的mRNA變化。結(jié)果表明，大鼠足底注射CFA 7 d出現(xiàn)了明顯的神經(jīng)病理性痛表現(xiàn)，脊髓背角GFAP mRNA顯著增高，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。LAA是星形膠質(zhì)細(xì)胞活性特異性抑制劑。本研究顯示，LAA明顯抑制了CFA大鼠脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，LAA組GFAP mRNA較CFA組明顯降低，LAA也顯著緩解了CFA大鼠炎性痛。研究結(jié)果提示脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞活化參與了CFA誘導(dǎo)的炎性痛。

本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有對(duì)脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞參與CFA炎性痛的機(jī)制進(jìn)行研究，但有研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化可釋放一氧化氮、興奮性氨基酸等炎癥因子和白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α等細(xì)胞因子，這些炎癥因子和細(xì)胞因子可與神經(jīng)元相應(yīng)受體結(jié)合，從而提高神經(jīng)元興奮性[1]，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化還可以上調(diào)神經(jīng)元谷氨酸受體的表達(dá)，增加神經(jīng)元興奮性[5]，這些都可能是星形膠質(zhì)細(xì)胞參與CFA誘導(dǎo)的炎性痛機(jī)制。

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