吳江鋒,李紅軍

(三峽大學醫(yī)學院,湖北 宜昌 443003 E-mail:313229177@qq.com)

冰凍切片具有制片迅速、簡便、切片較薄、組織變化不大、無需脫水及浸臘等特點[1],能很好地保存類脂、脂肪等成分,尤其在免疫組織化學染色中,更能完好地保存大部分的抗原活性及各種酶類。尤其對有機溶劑或熱溫度耐受差的細胞表面抗原和水解酶的保存就更好。常用于臨床診斷和科學研究。要制作高質量的冰凍切片并非易事,受到多種因素的影響。筆者通過多年的實踐總結了一些體會,供同仁們參考。

1 材料和方法

1.1 儀器及試劑 德國Leica-CM1900型恒溫冷凍機、一次性切片刀片、普通膠水、甲醇、蘇木精染液、2%鹽酸、蔗糖、明膠。

1.2 切片前的準備

1.2.1 冰凍切片機的準備 冰凍切片機在備用狀態(tài)下,設置夜間除霜,白天根據不同標本預設溫度,避免經常開關機。使用前將刀架與組織塊的角度調整好,調節(jié)好防卷板的位置,保持防卷板干凈、平整,凍頭清洗干凈[2]。

1.2.2 載玻片預處理 將載玻片用1%HCl浸泡0.5h,撈出用清水沖洗干凈再用95%的酒精浸泡10min,蒸餾水洗凈,烤干后備用。

1.2.3 托物臺預處理 將數個托物臺放入-20℃冰箱中預處理10min左右。

1.3 取材 動物和人死后2h內材料均可供取。材料越新鮮越好,取材要快速準確平整。厚度一般＜2cm×2cm×2cm。

1.4 包埋 細小的組織需用普通膠水包埋,對破脆較小的組織標本,預先用少許膠水涂于切片托上做一冰臺,墊高后再放小塊組織進一步冰凍。特殊的標本用蔗糖和明膠,其余均可直接放置速凍臺。

1.5 切片 切片前要仔細觀察組織塊的變化,組織在冷凍過程中,從周邊開始變白,最后中間留下綠豆大小的反光區(qū),很快消失,這時及時固定組織托并開始修塊,因為最佳的切片溫度為-20℃到-23℃,大約10s左右?？焖偾衅?。

1.6 貼片 貼片時載玻片與刀面的角度要成40°左右,根據組織塊而定,如果防卷板礙事可直接貼。依靠載玻片的熱量將組織切片吸起,自然攤平。

1.7 固定染色 切好的片子立即放入甲醇固定液中1～2min。固定液要及時更換。切片從固定液中取出后迅速水洗,蘇木精染液中浸染2～3min,然后取出水洗并藍化。2%鹽酸乙醇分化數秒,0.1%氨水之藍,顯微鏡下觀察染色情況,以核染色清晰為度。伊紅缸內燃胞漿數秒,水洗,梯度乙醇脫水,兩個二甲苯透明,中性樹膠封片。

3 結果

通過上速方法切出的片子,組織結構形態(tài)完整,細胞染色清晰,無折疊。

4 討論

有一臺性能良好的冰凍切片機是冰凍切片質量的基礎,切片前,冰凍切片機的準備、載玻片和托物臺的預處理是切好冰凍切片的必不可少的重要環(huán)節(jié)。

新鮮、干凈、無雜質的材料是冰凍切片的必要保障。材料大小要合適,最理想的取材大小為1.5cm×1.5cm×1.5cm,該規(guī)格的材料不需要包埋。若材料太小可用膠水包埋,膠水包埋冷凍迅速,質感均勻,易切出完整的組織切片,易展片,留片后膠水易清洗、組織易分離、價廉、操作方便[3]。對于易脆的組織或者需要連續(xù)切片的組織,可用7.5%明膠-15%蔗糖對組織進行包埋,待明膠蔗糖呈凝膠狀時,根據需要修塊,錫紙包裹后放置到-80℃冰箱進一步冷凍(至少2h),切片前將組織塊移至冰凍切片機內復溫至少半小時后開始切片,使用7.5%的明膠-15%的蔗糖包埋組織后可以像石蠟切片一樣進行連續(xù)切片。蔗糖能使組織維持良好的形態(tài)、防止某些細胞成分的擴散,并充分保持酶的活性。高濃度的蔗糖具有脫水和防止冰晶形成的作用。明膠溶于水后,能相互吸引、交織。明膠與蔗糖混合后可以使蔗糖和水完全充塞在凝膠空隙內,使組織保持穩(wěn)定的狀態(tài),起到吸水和支撐骨架的作用。

冷凍時間和溫度的把握是切好冰凍切片的關鍵[4]。為了減少冰晶出現,有效防止冰晶擠壓周圍組織,改變形態(tài)結構,需要將組織塊快速地移至冷凍頭。恒冷箱切片機的室內溫度以-15℃到-22℃為宜,而冷凍頭的溫度要根據組織的性質、軟硬度而定。如淋巴結、肝、脾、腎組織,溫度設定在-18℃到-20℃為宜;甲狀腺、肺組織為-20℃到-22℃;對于質韌、硬的組織如子宮、致密結締組織的設置溫度要達到-23℃到-26℃,切片速度也要相對慢一些,過快會出現跳刀現象;脂肪組織要降至-30℃。切片的時間要把握得當,時間過短冷凍不好,時間過長則會使組織變硬,不僅損傷刀而且組織片也會出現裂痕。經驗表明,用戴乳膠手套的拇指輕輕按壓回溫[5],如組織塊變脆應立即升溫,也可用手指在組織表面摸一下再切。

切片時其他細節(jié)的把握也是提高切片質量的重要補充。切片時切片刀的角度要調整合適,防卷板調整到切片刀5°左右的角度,防卷板的前緣與刀面要有足夠的距離,略高于刀刃的最高點,固定好后不要輕易移位,使切出的切片順利通過刀與防卷板間的縫隙。修塊時切忌進刀太慢,避免組織斷裂。刀速要均勻,其快慢要根據不同的組織而定。貼片要細心而快速,手部切勿上下移動更不能顫抖,而且在貼附組織時手要有一個向下的伸展動作,片子若有卷曲,可用質量好的毛筆輕輕壓切片前緣把切片展平,及時附貼于干凈的載玻片上后,立即置于固定液中。固定后的組織可直接染色或完全自然干后儲存于-80℃冰箱。此外,切片時,為了防止升溫,切片機的蓋子打開得越小越好。固定液的選用,我們傾向于甲醇,甲醇具有乙醇的固定作用,收縮性比乙醇小得多,且具有快速固定、染色清晰等優(yōu)點。

總之,筆者的體會是,要制作好一張優(yōu)質的冰凍切片,需要控制好各個操作環(huán)節(jié),而操作人員一絲不茍的工作態(tài)度和責任感是獲得完美結果的關鍵。

[1]陳潔,張雯靜,李堅.冰凍切片制作中時間和溫度的研究[J].現代實用醫(yī)學,2010,22(5):587.

[2]曾訓,徐洪.控制冰凍切片質量的探討[J].中國誤診學雜志,2009,9(22):5393-5394.

[3]王曉鴻,茍新敏,林宇靜.制作冰凍切片對包埋劑的選擇及應用[J].中國實用醫(yī)藥,2009,4(36):217-218.

[4]劉曉蘭,劉燕,宋月晗,等.冰凍切片制作體會及常見問題[J].現代生物醫(yī)學進展,2010,10(14):2738.

[5]李建紅,石天峰.冰凍切片制作方法改進探討[J].長治醫(yī)學院學報,2007,21(4):306.