● 唐曉敏 秦正玉 何宗寶 王家琳 吳生兵 汪克明

缺血性腦卒中是由于腦部血液供應(yīng)障礙，缺血、缺氧而引起的局限性腦組織的壞死或腦軟化。本病屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”的范疇，源于《內(nèi)經(jīng)》對(duì)中風(fēng)病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)。針灸在治療缺血性腦卒恢復(fù)期的治療中具有優(yōu)勢，一定程度上提高了缺血性腦卒中患者的神經(jīng)功能恢復(fù)［1，2］。電針治療對(duì)缺血再灌注大鼠模型神經(jīng)功能恢復(fù)及海馬區(qū)神經(jīng)可塑性相關(guān)基因15(CPG15，candidate plasticity－related gene 15)表達(dá)會(huì)產(chǎn)生怎樣影響，CPG15在針刺抗腦缺血損傷中樞神經(jīng)重塑過程中的作用機(jī)制是怎樣的，本實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行了探討。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康成年SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量為220±20g，購自南京安立默實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(蘇)2009－0007號(hào)。同等條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。按照隨機(jī)分組方法，將60只SD大鼠分為正常對(duì)照組、腦缺血再灌注模型組、電針“百會(huì)、風(fēng)府”組、電針非經(jīng)穴組、尼莫地平治療組，每組各12只。

1.2 藥品 水合氯醛，批號(hào):W20091022，生產(chǎn)企業(yè):中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;80萬單位青霉素，批號(hào):20100627，生產(chǎn)企業(yè):哈藥集團(tuán)制藥總廠;尼莫地平，批號(hào):20100509，生產(chǎn)企業(yè):上海信誼嘉華藥業(yè)有限公司;多聚甲醛，批號(hào):091020，生產(chǎn)企業(yè):中國醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司。

1.3 主要試劑及儀器 CPG15單克隆抗體(BS－2464R)，生產(chǎn)批號(hào):909881W，購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;SP－9000，生產(chǎn)批號(hào)812257A，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;3－二氨基聯(lián)苯胺(diam inobenzidine，DAB)顯色試劑盒，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;一抗稀釋液，購自碧云生物技術(shù)研究所;抗原修復(fù)液，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;L734型冷光立式四孔手術(shù)無影燈，上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療器械五廠;PCE－A型程控電針治療儀，安徽天恒有限公司制;932型電熱燒灼器，上海醫(yī)療器械八廠;TB－718自動(dòng)包埋機(jī)，泰維電子設(shè)備有限公司;LEICA RM2135自動(dòng)切片機(jī)，LEICA公司;TK2218I恒溫?cái)偲酒瑱C(jī)，泰維電子設(shè)備有限公司;OLYMPUS VANOX顯微鏡，日本OLYMPUS光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社;LEICA ASP200自動(dòng)脫水機(jī)，LEICA公司;南京捷達(dá)JD2801形態(tài)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)，南京捷達(dá)科技發(fā)展有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件 動(dòng)物于安靜的環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫控制在(24±1)℃的范圍、相對(duì)濕度(55±5)%的環(huán)境中，12h明暗交替，塑料籠內(nèi)以無菌木屑做墊料，食水自取。

2 方法

2.1 模型制作方法 參照Zea Longa方法［3］，使用一端涂抹硅樹脂尼龍絲，將尼龍絲插入右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈，閉塞大腦中動(dòng)脈(MCA)，阻斷MCA的血流2小時(shí)，后將尼龍絲輕輕拔出，從而復(fù)制腦缺血再灌注(BI/R)大鼠模型，模型復(fù)制成功的標(biāo)志為大鼠出現(xiàn)右側(cè)Horner綜合征(左側(cè)瞳孔縮小)，麻醉清醒時(shí)出現(xiàn)左前肢或左前后肢癱瘓，線栓拔出后頸內(nèi)動(dòng)脈、Willis環(huán)無血栓及出血為標(biāo)準(zhǔn)。術(shù)后傷口部碘伏消毒，術(shù)后3天連續(xù)腹腔注射青霉素鈉(8萬U/d)預(yù)防感染。

2.2 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 采用Longa 5分法標(biāo)準(zhǔn)［3］，在大鼠腦缺血2h再灌注動(dòng)物蘇醒時(shí)和治療2周后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分:0分，無神經(jīng)損傷癥狀;1分，不能伸展對(duì)側(cè)前爪;2分，向外側(cè)劃圈;3分，向?qū)?cè)傾倒;4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。

2.3 治療方法 電針經(jīng)穴組選擇“百會(huì)”、“風(fēng)府”穴，具體定位:“百會(huì)”穴位于大鼠頂骨與頂間骨之間凹陷處;“風(fēng)府”穴位于枕骨下方正中凹陷處。針刺方法:穴位處常規(guī)消毒后，以30號(hào)1寸毫針斜刺入“百會(huì)”穴、“風(fēng)府”穴約0.5寸，將針柄分別連接至電針儀上，“百會(huì)”穴接陰極，“風(fēng)府”穴接陽極，電針頻率2Hz，疏波，強(qiáng)度以大鼠安靜耐受為度，一般3～5mA，時(shí)間30min，每天1次，均在上午10點(diǎn)左右進(jìn)行，連續(xù)治療2周。電針非經(jīng)穴組統(tǒng)一選擇右臀部非經(jīng)非穴位置針刺，接電針刺激，刺激參數(shù)同電針經(jīng)穴組。西藥治療組以尼莫地平混懸液，按20mg/kg·d量灌胃，每日2次(上午8點(diǎn)，下午4點(diǎn))，連續(xù)灌胃治療2周。

2.4 標(biāo)本取材 于造模后2周各個(gè)相應(yīng)的時(shí)間位點(diǎn)以10%水合氯醛麻醉(3.6mL/kg)大鼠，打開胸腔，于右心耳部剪一小口，從左心室插入導(dǎo)管至主動(dòng)脈，向內(nèi)快速注入37℃肝素化生理鹽水250mL，至右心耳流出液變清亮，然后注入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液250mL，灌流固定30min后斷頭取腦，除去小腦和腦干，取大腦，放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定1d，脫水、透明、浸蠟，在視交叉前后連續(xù)制作腦部冠狀切片。

2.5 指標(biāo)檢測 SP染色:Ⅰ抗CPG15稀釋濃度為1∶100，陰性對(duì)照組采用正常山羊血清替代Ⅰ抗進(jìn)行，DAB2H2O2顯色液顯色，蘇木精輕度復(fù)染。

2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 根據(jù)大鼠腦缺血半暗帶的定位方法，相近部位同倍10×40，7個(gè)不同視野，采用南京捷達(dá)JD－801圖像分析系統(tǒng)，統(tǒng)計(jì)海馬區(qū)CPG15陽性細(xì)胞總面積單位和平均光密度值。所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)的兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分對(duì)比 見表1。由表1可以看出模型組大鼠神經(jīng)功能缺損顯著差于正常對(duì)照組，P＜0.01。電針經(jīng)穴組與西藥治療組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分差異不顯著，P＞0.05;而較模型組兩者均有顯著性差異，P＜0.01;較正常對(duì)照組有一定差異性，P＜0.05。電針非經(jīng)穴組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分與模型組比較差異不明顯，P＞0.05，且顯著弱于電針經(jīng)穴組和西藥對(duì)照組，P＜0.01。

表1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分治療前后對(duì)比(分)

表1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分治療前后對(duì)比(分)

注:與正常對(duì)照組比較，▲▲P＜0.01，▲P＜0.05;與腦缺血再灌注模型組比較，＊＊P＜0.01，*P＜0.05;與電針“百會(huì)、風(fēng)府”組比較，##P＜0.01，#P＜0.05;與電針非經(jīng)穴組比較，★★P＜0.01，★P＜0.05;與尼莫地平治療組比較，◆◆P＜0.01，◆P ＜0.05。

周后正常對(duì)照組 12 0 0＊＊#★★◆組別 數(shù)量(只) 治療前 2模型組 12 2.796 ±0.186 2.524 ±0.482▲▲##◆◆電針經(jīng)穴組 12 2.652 ±0.224 0.794 ±0.156▲＊＊★★電針非經(jīng)穴組 12 2.787 ±0.253 1.986 ±0.269▲▲##◆◆西藥治療組 12 2.543 ±0.149 0.788 ±0.346▲＊＊★★

3.2 光鏡下觀察結(jié)果 光鏡下，正常組只見極少量棕褐色的CPG15陽性細(xì)胞表達(dá)，而BI/R模型組、電針經(jīng)穴組、電針非經(jīng)穴組、藥物治療組腦中均可見不同程度的棕褐色的CPG15陽性細(xì)胞，以海馬區(qū)陽性細(xì)胞密度增加為顯著。呈卵圓形或圓形，陽性細(xì)胞胞漿染色較深，多為星形膠質(zhì)細(xì)胞。以正常羊血清代替CPG15一抗孵育對(duì)照組的切片，結(jié)果為陰性，見圖1。從各組照片可以看出正常組大鼠海馬區(qū)CPG15陽性細(xì)胞胞漿染色極淺，量少，而其余四組大鼠海馬區(qū)CPG15陽性細(xì)胞胞漿染色明顯變深，量多，其中以電針經(jīng)穴組與西藥治療組CPG15陽性細(xì)胞胞漿染色最為顯著，而電針非經(jīng)穴組大鼠海馬區(qū)CPG15陽性細(xì)胞胞漿染色相對(duì)較淺，與模型組差異不明顯。

圖1 免疫組化方法檢測各組大鼠缺血再灌注海馬區(qū)CPG15蛋白表達(dá)情況

3.3 免疫組織化學(xué)方法檢測海馬組織CPG15 見表2。由表2可以看出正常組CPG15陽性細(xì)胞表達(dá)不顯著，平均光密度值低，較其他各組均有顯著性差異，P＜0.01;其他各組CPG15陽性細(xì)胞表達(dá)及平均光密度值均有提高，且電針經(jīng)穴組與尼莫地平組表達(dá)最明顯，此兩組之間比較差異性不顯著，P＞0.05，但較模型組和電針非經(jīng)穴組有顯著性差異，P＜0.01，而模型組與電針非經(jīng)穴組CPG15陽性細(xì)胞表達(dá)及平均光密度值比較，差異性不大，P＞0.05。說明電針和西藥尼莫地平對(duì)于增強(qiáng)CPG15的表達(dá)起到明顯促進(jìn)作用。

表2 各組缺血2h再灌注CPG15表達(dá)陽性細(xì)胞單位面積和平均光密度值治療后對(duì)比

4 討論

CPG15是以色列科學(xué)家Nedivi等于1993年通過構(gòu)建谷氨酸類似物海人藻酸(KA，kainic acid)激活型大鼠海馬齒狀回 cDNA文庫得到的一個(gè)基因［4］。1996年，Nedivi［5］從KA激活型大鼠海馬齒狀回cDNA文庫和人類皮質(zhì)cDNA文庫篩選、鑒定得到CPG15，并進(jìn)行了初步的功能研究發(fā)現(xiàn)CPG15能促進(jìn)神經(jīng)突起的快速生長，故又將其命名為Neuritin。CPG15是一個(gè)在神經(jīng)系統(tǒng)高度表達(dá)的基因［6］，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中主要在海馬、嗅球中表達(dá);而在成年后，表達(dá)限制在那些發(fā)生結(jié)構(gòu)改變并與神經(jīng)活動(dòng)密切相關(guān)的組織［7］。CPG15蛋白能促進(jìn)神經(jīng)突起的生長及其分支和突觸的發(fā)育成熟，調(diào)節(jié)突觸回路的形成;其表達(dá)主要局限于神經(jīng)系統(tǒng)以及神經(jīng)可塑性相關(guān)的區(qū)域，且神經(jīng)活動(dòng)和神經(jīng)營養(yǎng)素(neurotrophines，NTs)均能誘導(dǎo)其表達(dá)，提示CPG15可能與神經(jīng)活動(dòng)及NTs促進(jìn)神經(jīng)突起生長的作用有關(guān)［8］。這些特點(diǎn)使CPG15成為神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育成熟及創(chuàng)傷修復(fù)中重要候選因子。CPG15在促進(jìn)突觸成熟、防止神經(jīng)細(xì)胞凋亡、保護(hù)神經(jīng)元等方面有重要作用［9］。并且介導(dǎo)神經(jīng)生長因子(NGF)促進(jìn)成人感覺神經(jīng)元軸突的生長［10］。

神經(jīng)細(xì)胞之間通過特異的通訊結(jié)構(gòu)——“突觸”形成功能性神經(jīng)環(huán)路來傳遞和存儲(chǔ)信息。突觸在神經(jīng)細(xì)胞持續(xù)活動(dòng)影響下可發(fā)生特異性的結(jié)構(gòu)和功能變化，這稱之為“突觸可塑性”。它在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和學(xué)習(xí)記憶中起著至關(guān)重要的作用。電針治療腦梗塞的生物學(xué)基礎(chǔ)是通過多種機(jī)制影響神經(jīng)元可塑性，目前關(guān)于針灸對(duì)腦神經(jīng)可塑性研究已見部分報(bào)道，盧圣鋒等［11］以SAMP8小鼠作為老年癡呆(AD)動(dòng)物模型，電針“百會(huì)”、“涌泉”穴，發(fā)現(xiàn)電針能有效調(diào)整海馬神經(jīng)元突觸形態(tài)，使突觸后致密物增厚，突觸間隙寬度變窄，促進(jìn)突觸形態(tài)可塑性的發(fā)揮。徐虹等［12］觀察到，電針能夠抑制損傷相關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞信號(hào)表達(dá)，促進(jìn)修復(fù)相關(guān)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，認(rèn)為針刺可能通過上調(diào)損傷－修復(fù)網(wǎng)絡(luò)功能，促進(jìn)梗死區(qū)神經(jīng)功能的恢復(fù)。高劍鋒等［13］研究發(fā)現(xiàn)局灶腦缺血再灌注可激活老齡大鼠海馬角回(dentate gyrus，DG)區(qū)域的神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移，針刺穴位能使局灶腦缺血再灌注后海馬DG區(qū)域的神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生明顯增殖，有效提高神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)元分化，合理調(diào)控膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)，從而發(fā)揮拮抗腦缺血再灌注損傷作用。趙丹等［14］研究多巴胺D1、D2受體在腦缺血后神經(jīng)可塑性中的作用及電針的影響，發(fā)現(xiàn)電針可以對(duì)腦缺血后多巴胺D1、D2受體的數(shù)量和功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，減輕其損害作用，促進(jìn)其達(dá)到平衡狀態(tài)，從而對(duì)神經(jīng)功能進(jìn)行保護(hù)和修復(fù)。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示針刺對(duì)促進(jìn)大鼠缺血再灌注損傷區(qū)CPG15陽性細(xì)胞含量的表達(dá)起到顯著促進(jìn)作用，同時(shí)神經(jīng)功能得到明顯改善，說明針刺對(duì)腦神經(jīng)可塑性具有促進(jìn)意義。據(jù)此我們認(rèn)為針灸治療腦梗塞，促進(jìn)腦神經(jīng)可塑性的機(jī)制可能是通過上調(diào)CPG15而發(fā)揮作用。CPG15基因參與了腦缺血損傷后神經(jīng)再生的調(diào)控。

百會(huì)、風(fēng)府均為督脈經(jīng)穴，督脈又歸屬于腦。此外，根據(jù)《靈樞·衛(wèi)氣》中“氣街”理論，“頭氣有街”、“氣在頭者，止之于腦”，即經(jīng)氣到頭部的都聯(lián)系于腦。又根據(jù)“四?！崩碚摚澳X為髓?！?，楊上善注說“胃流津液滲入骨空，變而為髓，頭中最多，故為海也，是腎所生，其氣上輸腦蓋百會(huì)穴，下輸風(fēng)府也”?？梢姡贂?huì)穴、風(fēng)府穴與腦密切聯(lián)系，是調(diào)節(jié)大腦功能的要穴。針刺百會(huì)、風(fēng)府穴，具有醒腦開竅、健腦補(bǔ)髓、疏風(fēng)通絡(luò)的功效，因此選取此二穴作為電針治療腦缺血再灌注損傷模型的處理穴位。本次實(shí)驗(yàn)證實(shí)了針刺“百會(huì)”、“風(fēng)府”可以促進(jìn)大鼠受損神經(jīng)功能恢復(fù)，能提高大鼠海馬區(qū)CPG15表達(dá)，說明電針對(duì)腦缺血再灌注后腦細(xì)胞的神經(jīng)可塑性有促進(jìn)作用。這為臨床針灸治療腦梗塞提供了理論依據(jù)。

［1］楊福霞，楊卓欣，于海波，等.調(diào)任通督針法治療腦梗塞恢復(fù)期患者的臨床觀察［J］.針灸臨床雜志，2011，27(4):47 －48.

［2］倪麗偉，申鵬飛，張智龍，等.“醒腦開竅”與非經(jīng)非穴針刺對(duì)腦梗塞急性期神經(jīng)功能影響的多中心隨機(jī)對(duì)照研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2011，26(5):894 －897.

［3］Zea Longa E L，Weinstein P R，Carlson S，et a1.Re－versible middle cerebral artery:occlusion without raniectomy in rats［J］.Stroke，1989，(20):84－91.

［4］NediviE，HevroniD，Naot D，et al.Numerous candidate plasticity － related gense revealed by differential cDNA cloning［J］.Nature，1993，363(6431):718－722.

［5］Nedivi E，F(xiàn)iedust S，Theill LE，et al.A set of genes expressed inresponse to light in the adult cerebral cortex and regulated duringdevelopment［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(5):2048 －2053.

［6］黃 瑾，楊 磊，應(yīng) 康，等.人類 Neuritin cDNA的克隆與表達(dá)［J］.復(fù)旦大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2001，40:521－524.

［7］Yamagata K，Sugiura H，SuzukiK.Structure and function of neuralplasticity－related gene products［J］.Neurobid learn Mem，1998，7037 －43.

［8］Putz U，Harwell C，Nedivi E.Soluble CPG15 expressed during earlydevelopment rescues cortical progenitors from apoptosis［J］.Nat Neurosci，2005，8(3)322 －331.

［9］Fujino T，Wu Z，Lin WC，etal.Cpg15 and cpg15 －2 constitute a family ofactivity－regulated ligands expressed differentially in the nervous system to promote neurite growth and neuronal surviva.Comp Neuro［J］.2008，507(5):1831－1845.

［10］Karamoysoyli E，Burnand RC，Tomlinson DR，etal.Neuritin Mediates Nerve Growth Factor－Induced AxonalRegeneration and IsDeficient in Experimental Diabetic Neuropathy［J］.Diabetes，2008，57(1):181 －189.

［11］盧圣鋒，邵 欣，唐 勇，等.電針促進(jìn)阿爾茨海默病模型小鼠(SAMP8)海馬神經(jīng)元突觸可塑性的神經(jīng)細(xì)胞黏附機(jī)制［J］.中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2008，23(12):1057 －1060.

［12］徐 虹，洪禮傳，黃艷秋，等.針刺對(duì)腦缺血再灌注模型大鼠腦組織基質(zhì)金屬蛋白酶、細(xì)胞間黏附分子表達(dá)的影響［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2010，30(7):37 －42.

［13］高劍峰，呂風(fēng)華，朱長連，等.電針干預(yù)對(duì)老齡大鼠腦缺血再灌注海馬內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2010，25(7):1075－1079.

［14］趙 丹，雷 慧，葛林寶，等.多巴胺D1、D2受體在腦缺血后神經(jīng)可塑性中的作用及電針的影響［J］.山東醫(yī)藥，2010，50(80):109－110.