黃永震,賀 花,陳 宏

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院,陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點實驗室,陜西 楊凌 712100)

動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究新進(jìn)展及其在牛育種上的應(yīng)用

黃永震,賀 花,陳 宏＊

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院,陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點實驗室,陜西 楊凌 712100)

動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)已應(yīng)用于生命科學(xué)的各個領(lǐng)域,尤其在研究基因功能、轉(zhuǎn)基因動物育種(抗病育種和提高生產(chǎn)性能)、治療人類疾病(生產(chǎn)藥用蛋白、干細(xì)胞治療和種器官移植)等方面得到了廣泛的應(yīng)用。本文從轉(zhuǎn)基因技術(shù)的歷史和發(fā)展?fàn)顩r入手,簡要介紹了幾種傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)方法,重點綜述了近幾年為提高轉(zhuǎn)基因效率和轉(zhuǎn)基因精確調(diào)控的一些新技術(shù)。另外,本文就轉(zhuǎn)基因技術(shù)在牛育種方面的研究現(xiàn)狀,以及對轉(zhuǎn)基因技術(shù)在牛新品種培育和生物制藥等領(lǐng)域的應(yīng)用和前景進(jìn)行了綜述。

動物轉(zhuǎn)基因技術(shù);轉(zhuǎn)基因效率;轉(zhuǎn)基因精確調(diào)控

轉(zhuǎn)基因動物實驗可追溯到1974年,Brackets等將兔的精子與SV40病毒DNA孵育后,進(jìn)行體外受精獲得轉(zhuǎn)基因兔。同年,Jaenisch等將SV40病毒DNA注射到小鼠胚胎囊腔中,獲得攜帶外源基因的嵌合體小鼠。1980年,Gordon等首次報道用原核注射獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠。此后,世界各國相繼開展轉(zhuǎn)基因動物的研究。1982年,美國科學(xué)家Palmiter等將大鼠生長激素(GH)基因?qū)胄∈笫芫阎蝎@得轉(zhuǎn)基因“超級鼠”,被認(rèn)為是世界上首批轉(zhuǎn)基因動物。直到1990年,美國Genzym e T ransgene公司才通過原核顯微注射法獲得了世界上第1頭轉(zhuǎn)基因牛。但由于牛本身具有產(chǎn)奶量大等獨(dú)特優(yōu)勢,還是吸引了不少科學(xué)家對其進(jìn)行研究,尤其是在 1997年,英國羅斯林研究所首次利用羊體細(xì)胞獲得克隆羊多莉,表明高等動物也可以由無性生殖來繁殖[1]。同年,乳腺中表達(dá)人凝血因子IX的轉(zhuǎn)基因克隆羊Polly培育成功[2]。2005年抗乳房炎轉(zhuǎn)基因牛的誕生[3],2006年多不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)基因克隆豬的培育成功[4],標(biāo)志著轉(zhuǎn)基因動物育種進(jìn)入了新的發(fā)展歷程。2009年生產(chǎn)高比例的抗原特異性人源抗體的轉(zhuǎn)染色體牛的出生[5],是轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥用蛋白的又一個里程碑。

隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展,從顯微操作技術(shù)、體細(xì)胞核移植技術(shù)、精子介導(dǎo)載體法和胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法等傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)方法,到結(jié)合基因打靶技術(shù)、生殖干細(xì)胞介導(dǎo)法和鋅指核酸酶介導(dǎo)的敲除或轉(zhuǎn)基因技術(shù)等現(xiàn)代生產(chǎn)方法的不斷出現(xiàn),轉(zhuǎn)基因技術(shù)將會不斷得到完善,這項技術(shù)必將在未來的動物育種中將發(fā)揮巨大的作用。

1 傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)

1.1 顯微操作技術(shù)

顯微操作技術(shù)(micromanipulation technique):是用精細(xì)的顯微注射針將外源基因直接注入牛受精卵的雄原核,使外源基因整合到基因組,從而獲得轉(zhuǎn)基因動物。

1982年,Palmiter等首次將大鼠生長激素基因與金屬硫蛋白基因啟動子拼接成融合基因,導(dǎo)入小鼠受精卵后,獲得了轉(zhuǎn)基因級鼠?，F(xiàn)在的轉(zhuǎn)基因動物研究大都是在Palmiter等方法的基礎(chǔ)上改進(jìn)進(jìn)行的,顯微注射技術(shù)是一種應(yīng)用比較廣泛、效果比較穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因動物制作方法,在轉(zhuǎn)基因牛的研究中,Brandl等[6]利用該方法成功制作成了轉(zhuǎn)基因兔、轉(zhuǎn)基因豬和轉(zhuǎn)基因綿羊。目前通過顯微注射法已經(jīng)獲得的轉(zhuǎn)基因動物有小鼠、兔、豬、羊、牛和魚等。

1.2 體細(xì)胞核移植技術(shù)

體細(xì)胞核移植技術(shù)(nuclear transplantation of animal somatic cells):是先把外源基因整合到供體細(xì)胞上,然后將供體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到去核卵母細(xì)胞,組成重構(gòu)胚胎,再把其移植到假孕母體,待其妊娠、分娩后便可得到轉(zhuǎn)基因動物。

1997年,首例體細(xì)胞核移植綿羊在世界上誕生,之后不久出現(xiàn)了體細(xì)胞核移植小鼠及牛,并通過體細(xì)胞核移植技術(shù)制作了轉(zhuǎn)基因動物。體細(xì)胞克隆不同于其它供體細(xì)胞,它為轉(zhuǎn)基因技術(shù)開辟了新的紀(jì)元,事實證明了選擇體細(xì)胞作供體細(xì)胞能生產(chǎn)高比例的轉(zhuǎn)基因后代。在體細(xì)胞核移植生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物過程中,人們將綠色熒光蛋白導(dǎo)入供體細(xì)胞,使重構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因胚胎便于鑒定,通過轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白體細(xì)胞核移植已生產(chǎn)出了轉(zhuǎn)基因后代小鼠、豬和牛。

1.3 胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法

胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法(embryonic stem cell-mediated):首先將基因?qū)肱咛ビ诩?xì)胞;然后將轉(zhuǎn)基因的胚胎干細(xì)胞注射于動物囊胚后可參與宿主的胚胎構(gòu)成,形成嵌合體,再將這種嵌合體動物與正常動物連續(xù)交配,則可生產(chǎn)出轉(zhuǎn)基因動物。

1.4 精子介導(dǎo)載體法

精子介導(dǎo)載體法(sperm-mediated gene transfer):使具有受精能力的精子與外源 DNA一起孵育,然后將該精子用于人工授精或體外受精,以期獲得轉(zhuǎn)基因動物。

1989年,科學(xué)家首次利用小鼠精子與DNA溫育產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。由于結(jié)果不穩(wěn)定,目前,該方法體系還未完全建立成熟,但是它是非常有發(fā)展前途的一種方法。它可以與體外受精、早期胚胎陽性選擇和胚胎超低溫保存技術(shù)相結(jié)合,使轉(zhuǎn)基因技術(shù)更加實用化、簡單化。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法(retrovirus-mediated gene transfer):主要是利用其DNA的LTR區(qū)域的活性特點,將外源基因連接到LTR下部進(jìn)行重組后,包裝成高滴度病毒顆粒,去直接感染受精卵,或微注入囊胚腔中。病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因是一種溫和的轉(zhuǎn)基因方法,同時也是對細(xì)胞損傷較小的一種轉(zhuǎn)染方式,并且可以得到較高的轉(zhuǎn)染效率。

1985年,Jaenisch等人成功地用逆轉(zhuǎn)錄病毒法獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠。2007年,Ryu等[7]利用病毒載體感染精原干細(xì)胞,再將其注射到大鼠睪丸中,得到的轉(zhuǎn)基因大鼠表達(dá)的外源基因可以穩(wěn)定遺傳。

2 現(xiàn)代的轉(zhuǎn)基因技術(shù)

2.1 基因打靶技術(shù)(提高轉(zhuǎn)基因精確性)

基因打靶技術(shù)(gene targeting protocols):是指通過同源重組將外源基因定點整合入靶細(xì)胞基因組上某一確定的位點,以達(dá)到定點修飾改造染色體上某一基因為目的的一項技術(shù)。該技術(shù)可細(xì)分為:胚胎干細(xì)胞基因打靶;體細(xì)胞基因打靶和條件性基因打靶。該技術(shù)克服了隨機(jī)整合的盲目性和危險性,是一種理想的修飾、改造生物遺傳物質(zhì)的方法。

2000年,McCreath等[12]首次利用基因打靶技術(shù)生產(chǎn)了轉(zhuǎn)基因克隆羊,證實了基因打靶技術(shù)可用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因大家畜。2003年,Yutaka等[13]利用基因敲除的方法獲得了1,3半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因滅活的轉(zhuǎn)基因牛,首次在牛中實現(xiàn)了基因打靶技術(shù)。

2.2 RNA干擾介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(提高轉(zhuǎn)基因精確性)

RNA干擾(RNA interference,RNAi):是雙鏈RNA介導(dǎo)的特異性基因表達(dá)沉默現(xiàn)象。利用該方法,可以部分地抑制特定內(nèi)源基因的表達(dá),或通過mRNA的降解使目的基因表達(dá)下調(diào)沉默,從而實現(xiàn)基因表達(dá)調(diào)控的時空性和可逆性。

2005年,Acosta等[14]設(shè)計了斑馬魚Myostatin基因的干擾片段并注入其受精卵,這段干擾片段解除該基因?qū)∪饨M織生長和發(fā)育的抑制作用,產(chǎn)生肌肉發(fā)達(dá)的斑馬魚。2007年,Dickins等[15]將啟動子四環(huán)素反應(yīng)元件(T RE)與RNA干擾基因結(jié)合后轉(zhuǎn)入小鼠中,成功轉(zhuǎn)入的小鼠再與轉(zhuǎn)有轉(zhuǎn)錄因子(tTA)的小鼠雜交,制備出同時含有 TRE、RNA干擾基因以及tTA的轉(zhuǎn)基因小鼠。

2.3 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)(提高轉(zhuǎn)基因精確性)

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPS cells):是將幾種轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入已經(jīng)分化的體細(xì)胞中,使其重編程為類似胚胎干細(xì)胞的一種細(xì)胞類型。在轉(zhuǎn)基因動物研究中,將iPS細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)同動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合是一種創(chuàng)新,應(yīng)用該方法不僅可以避免種間繁殖障礙,克服親緣關(guān)系的制約,而且可獲得用傳統(tǒng)的交配方法無法得到的動物新性狀。

2006年,日本京都大學(xué)Takahashi等[16]將攜帶有Oct4、Sox2、Klf4和 c-Myc四種限定因子基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入小鼠成纖維細(xì)胞,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)入限定因子的成纖維細(xì)胞被誘導(dǎo)重編程為胚胎干細(xì)胞樣的多能性細(xì)胞,該細(xì)胞被稱為“誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞”。

2.4 慢病毒載體技術(shù)(提高轉(zhuǎn)基因效率)

慢病毒載體技術(shù)(lentiviral vector-mediated gene transfer):慢病毒隸屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒,由于具有較長的致病潛伏期因此被稱為慢病毒,它包括愛滋病病毒,貓科免疫缺陷病毒以及其他相關(guān)病毒。基于對愛滋病病毒HIV-1的研究,科學(xué)家已研發(fā)出極具吸引力的慢病毒載體技術(shù)系統(tǒng),該系統(tǒng)可將外源基因有效地整合到宿主染色體上,從而達(dá)到持久性表達(dá)目的基因,或抑制靶基因的表達(dá)。

目前,轉(zhuǎn)基因研究中,使用最多的病毒載體是慢病毒。慢病毒載體技術(shù)是一種高效的轉(zhuǎn)基因動物制備技術(shù),轉(zhuǎn)基因效率可達(dá)60%以上。2003年,Clark等利用慢病毒載體制備轉(zhuǎn)基因動物的效率高達(dá)80%～100%。

2.5 生殖干細(xì)胞法(提高轉(zhuǎn)基因效率)

1) 精原干細(xì)胞法(spermatogonial stem cells),即將外源基因整合入精原或卵原干細(xì)胞中,就有可能連續(xù)不斷地獲得成熟的結(jié)合有外源基因的精子或卵子,經(jīng)過體外受精過程,獲得整合有外源基因的轉(zhuǎn)基因動物。一般采用的技術(shù)方法為將DNA直接注射入睪丸、卵巢或者曲細(xì)精管中。

1994年,Brinster等[8]首先建立了該技術(shù),并實現(xiàn)了供體小鼠的精原干細(xì)胞在受體中進(jìn)行精子發(fā)生和單倍體的生殖遺傳。2008年,Honaramooz等[9]通過腺病毒攜帶GFP報告基因轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的山羊精原干細(xì)胞,采精后進(jìn)行體外受精,轉(zhuǎn)基因胚胎陽性率可達(dá)10%。這是第一個成功通過精原干細(xì)胞移植的方法進(jìn)行大家畜轉(zhuǎn)基因研究的報道,為建立轉(zhuǎn)基因大動物模型帶來了希望。

2) 原始生殖細(xì)胞法(primordial germ cells),是指能夠發(fā)育成為精子或卵子的祖先細(xì)胞,來源于胚胎生殖嵴,與來源于囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的胚胎干細(xì)胞同屬全胚層多能干細(xì)胞。

2002年,Natio等[10]從早期雞胚血液分離得到了原始生殖細(xì)胞法,利用脂質(zhì)體法導(dǎo)入LacZ基因,然后注入受體胚,在雞胚的生殖嵴表達(dá)了LacZ基因。2006年,Van de Lavoir等[11]將攜帶有綠色熒光蛋白基因的原始生殖細(xì)胞法注入孵化雞胚內(nèi),將孵化出的公雞與未轉(zhuǎn)入基因的母雞交配,成功獲得生殖腺轉(zhuǎn)入外源基因并帶有綠色熒光的雛雞。

2.6 轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因(提高外源基因的整合效率)

轉(zhuǎn)座子又稱跳躍基因,它是基因組上不必借助于同源序列就可以移動的DNA片段。它能夠在基因組內(nèi)自我復(fù)制,并隨機(jī)插入基因內(nèi)其它位點。

2005年,復(fù)旦大學(xué)發(fā)育生物研究所的科研人員改造了一種源于飛蛾的PB(Piggy Bac)轉(zhuǎn)座子可在小鼠等哺乳動物細(xì)胞中高效導(dǎo)入外源基因,并穩(wěn)定表達(dá)[17],從而創(chuàng)立了一個高效實用的哺乳動物轉(zhuǎn)座因子系統(tǒng)。這種技術(shù)可以將外源基因高效地整合到基因組中轉(zhuǎn)座酶目標(biāo)序列上,很大程度上提高了外源基因的整合效率。

2.7 人工染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因(提高外源基因的表達(dá)量)

人工染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因(artificial chromosome gene transfer):是體外重組的含有類似天然染色體組件的具有特定結(jié)構(gòu)的DNA分子。常見的有酵母人工染色體(YAC),細(xì)菌人工染色體(BAC),哺乳動物人工染色體(MACs)等。傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因研究中,由于外源基因不能攜帶足夠的調(diào)控元件以及受到染色體位置效應(yīng)的影響,往往表達(dá)量很低,甚至不表達(dá)或者異位表達(dá),這些都不利于轉(zhuǎn)基因動物的研究。由于人工染色體含有較多的調(diào)控元件以及側(cè)翼序列,受染色體位置效應(yīng)的影響較小,人工染色體的出現(xiàn)可以彌補(bǔ)上述不足,實現(xiàn)外源基因較高水平的表達(dá)。

2008年,楊鵬華[18]等將含有人乳鐵蛋白的BAC和GFP質(zhì)粒共注射,得到了乳腺特異性高表達(dá)乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因克隆牛。近兩年出現(xiàn)的RED/ET重組系統(tǒng)(Red/ET recombination)可以對BAC在細(xì)菌中進(jìn)行精確修飾,比如對BAC修飾后加入藥物篩選基因,然后通過電轉(zhuǎn)染的方法將含有篩選標(biāo)記基因的BAC導(dǎo)入體細(xì)胞并進(jìn)行藥物篩選,將篩選得到轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞進(jìn)行核移植。這樣克服了顯微注射方法效率低的缺點,提高了使用BAC進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的效率和實用性。

2.8 鋅指核酸酶介導(dǎo)的敲除或轉(zhuǎn)基因技術(shù)(提高外源基因的高效定點整合)

鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFNs):由一個DNA識別域和一個非特異性核酸內(nèi)切酶構(gòu)成。DNA識別域是由一系列鋅指蛋白串聯(lián)組成,每個鋅指蛋白識別并結(jié)合一個特異的三聯(lián)體堿基。鋅指核酸酶能識別特異的DNA序列,并在此特異位點產(chǎn)生一個DNA雙鏈切口,而后細(xì)胞固有的DNA修復(fù)機(jī)制通過同源重組或非同源末端連接將切口修復(fù),從而達(dá)到DNA靶向修飾的目的。鋅指核酸酶技術(shù)不僅將基因組靶向修飾的效率提高了3～5個數(shù)量級,而且具有極高的特異性。鋅指核酸酶激活了體內(nèi)的DNA損傷修復(fù)機(jī)制,可以大大提高基因打靶的效率。

2009年,Hockemeyer等[19]利用ZFN對人的ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞設(shè)計4對鋅指酶對OCT 4基因位點進(jìn)行打靶時發(fā)現(xiàn),有2對鋅指酶誘導(dǎo)的同源重組效率達(dá)到36%～94%。2009年,Geurts等[20]直接將ZFNs質(zhì)?；蛘呔幋aZFNs的mRNA直接注射到大鼠原核或者胚胎胞質(zhì)中,得到的子代大鼠檢測發(fā)現(xiàn)IgM基因和Rab38基因敲除的效率高達(dá)25%～100%,并且子代老鼠中發(fā)現(xiàn)一只實現(xiàn)了一次對兩個等位基因的敲除,而這在傳統(tǒng)的基因打靶中幾乎是不可能的。這種高效率的基因打靶使得基因敲除變得簡便易行,極大地方便了基因功能的研究和疾病模型的建立。同時,ZFN的應(yīng)用提高了同源重組的效率,在供體基因存在的情況下,實現(xiàn)了外源基因的高效定點整合。但是ZFN進(jìn)行基因打靶也存在脫靶的問題,有可能造成不可預(yù)知的后果,這需要在以后的研究中進(jìn)一步提高ZFN的特異性。

3 轉(zhuǎn)基因牛的研究進(jìn)展

3.1 國外研究進(jìn)展

1990年,荷蘭Pharming公司通過顯微注射法獲得世界上第一頭轉(zhuǎn)入有人乳鐵蛋白基因的公牛。該公牛與非轉(zhuǎn)基因母牛生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因后代母牛乳汁中表達(dá)了人乳鐵蛋白。

1998年,日本的科學(xué)家Cibelli等采用母牛輸卵管和子宮內(nèi)膜細(xì)胞為核供體獲得了世界首例體細(xì)胞克隆牛。同年,他們以胎兒成纖維細(xì)胞為核供體,用同樣的方法獲得了攜帶半乳糖苷酶外源基因轉(zhuǎn)基因牛。

2001年,Krimpenfort等利用顯微注射技術(shù)向牛體外受精早期胚胎注射外源基因,通過非外科手術(shù)法進(jìn)行胚胎移植,在所生的19頭牛中,經(jīng)檢測有2頭為轉(zhuǎn)基因牛。

2002年,Berkel等利用牛的酪蛋白啟動子與人乳鐵蛋白基因組的6.2 kb片段構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體,通過顯微注射獲得轉(zhuǎn)基因牛。

2002年,新西蘭與澳大利亞科學(xué)家合作也獲得了轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆牛。

2002年,Donovan等將編碼溶葡球菌酶的基因轉(zhuǎn)入奶?；蚪M中獲得轉(zhuǎn)基因牛,證明在其乳腺中表達(dá)的溶葡球菌酶可以有效預(yù)防由葡萄球菌引起的乳房炎[21]。

2003年,日本的科學(xué)家Yutaka等利用基因敲除的方法獲得了α-1,3半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因單等位基因滅活的轉(zhuǎn)基因牛,首次在牛中實現(xiàn)了基因打靶[13]。

3.2 國內(nèi)研究進(jìn)展

1999年,上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所黃淑幀等,利用向體外受精的早期胚胎中注射外源基因的方法成功培育出了我國第1頭轉(zhuǎn)入有人血清白蛋白基因的轉(zhuǎn)基因牛。

2002至2006年,中國農(nóng)業(yè)大學(xué)李寧教授及其科研團(tuán)隊利用轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆技術(shù),獲得了轉(zhuǎn)基因克隆奶牛49頭,存活29頭。人乳鐵蛋白、人α乳清白蛋白和人溶菌酶在轉(zhuǎn)基因牛乳中平均表達(dá)量達(dá)到了國際上最好水平。

2003年,中國農(nóng)業(yè)大學(xué)李寧課題組培育了10頭體細(xì)胞克隆牛。其中包括兩頭轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆牛:“樂娃”和“巖娃”?！皹吠蕖鞭D(zhuǎn)入了綠色熒光蛋白基因,“巖娃”創(chuàng)造了兩個世界首次:首次轉(zhuǎn)有人巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因;首次在同一頭牛中轉(zhuǎn)有3種外源基因(綠色熒光蛋白基因、人巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因和新霉素抗性基因)。標(biāo)志著我國轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆牛的生產(chǎn)技術(shù)體系已經(jīng)漸趨成熟。

2006年4月,中國工程院院士旭日干指導(dǎo)完成的體細(xì)胞克隆牛和轉(zhuǎn)基因克隆牛技術(shù)研究通過專家鑒定,該項目獲得內(nèi)蒙古首批3頭體細(xì)胞克隆牛、首例胚胎冷凍保存的體細(xì)胞克隆牛和首例攜帶有人胰島素基因的轉(zhuǎn)基因克隆牛。

2006年世界首例抗瘋牛病轉(zhuǎn)基因克隆牛在中國山東淄博誕生。

2010年5月,國家轉(zhuǎn)基因肉牛育種課題組主要成員在國家肉牛改良中心良種牛繁育場,實施了首批轉(zhuǎn)ω-6脂肪酸脫氫酶基因(FAT 1)的肉牛胚胎移植工作。

2010年7月,內(nèi)蒙古大學(xué)大動物研究中心與內(nèi)蒙古科維爾有限公司聯(lián)手育出轉(zhuǎn)基因克隆肉牛。這種轉(zhuǎn)基因克隆肉牛是在動物耳朵上提取細(xì)胞,再通過無性繁殖人工培育而成。這種牛因剔除了肌肉生長抑制素基因(Myostatin),從而與其他牛相比產(chǎn)肉量更多,肉質(zhì)優(yōu)良。

4 轉(zhuǎn)基因牛的應(yīng)用

4.1 研究基因功能和治療人類疾病

通過轉(zhuǎn)基因技術(shù),可以精確地失活或增強(qiáng)某些基因的表達(dá),研究基因功能,制作各種研究人類疾病的動物模型。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立人類疾病動物模型比其他方法有優(yōu)勢,它可以在動物原來遺傳背景的基礎(chǔ)上,通過改變某種基因的表達(dá)水平而實現(xiàn),用以研究外源基因在整體動物中的表達(dá)調(diào)控規(guī)律,從而對人類疾病的病因、發(fā)病機(jī)理和治療學(xué)產(chǎn)生極大的促進(jìn)作用。

日本科學(xué)家Kuroiw a等[22]將微細(xì)胞介導(dǎo)的染色體轉(zhuǎn)移技術(shù)(MMCT)與體細(xì)胞克隆技術(shù)相結(jié)合,把含有整個人類免疫球蛋白重鏈基因Ig H和輕鏈基因Igλ的染色體片段轉(zhuǎn)入牛的原代胎兒成纖維細(xì)胞,獲得了4只健康存活的轉(zhuǎn)基因克隆牛,它們的血液中能不同程度表達(dá)人類多克隆抗體,這些轉(zhuǎn)染色體牛無疑會極大地促進(jìn)利用動物生物反應(yīng)器大量生產(chǎn)人源化的抗體、酶、牛奶和其他藥用蛋白的研究工作。

李寧院士與合作者用轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)將人的巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因植入牛的基因組內(nèi),使其在牛奶中含有巖藻糖抗原,這種轉(zhuǎn)基因牛奶可作為口服藥,用來防治各種胃病,具有重要的醫(yī)學(xué)價值和經(jīng)濟(jì)社會價值。

4.2 應(yīng)用于生物反應(yīng)器,生產(chǎn)藥用蛋白

通過家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉價的人體藥用蛋白,一直是轉(zhuǎn)基因動物研究的熱點。從1987年Gordon等人在轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中得到人組織型纖維蛋白溶酶原激活因子,到現(xiàn)在已有數(shù)十種人體蛋白在家畜乳腺中表達(dá),這些蛋白可以用于治療人類相關(guān)疾病。

1990年12月,荷蘭Pharming公司用酪蛋白啟動子與人乳鐵蛋白(h LF)的cDNA構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因載體,通過顯微注射法獲得世界上第一頭名為 Herman的轉(zhuǎn)基因公牛。該公牛與非轉(zhuǎn)基因母牛生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因后代中1/4后代母牛乳汁中表達(dá)了人乳鐵蛋白。2002至2006年,中國農(nóng)業(yè)大學(xué)李寧教授及其科研團(tuán)隊利用轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆技術(shù),獲得了轉(zhuǎn)基因克隆奶牛49頭,存活29頭。人乳鐵蛋白在轉(zhuǎn)基因牛乳中平均表達(dá)量達(dá)到3.43 g/L,人α乳清白蛋白表達(dá)量也達(dá)到1.55g/L,人溶菌酶在轉(zhuǎn)基因牛乳中含量達(dá)1.50 g/L以上,這些重組蛋白表達(dá)量達(dá)到了國際上最好水平。

近十幾年來,在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)制取新藥方而取得了驚人的成就,目前已在牛的乳汁中生產(chǎn)出一些人類蛋白質(zhì)藥物:抗凝血酶、纖維蛋白原、人血清白蛋白、膠原蛋白、乳鐵蛋白、糖基轉(zhuǎn)移酶、蛋白C等。

4.3 提高抗病能力

2004年,日美聯(lián)手利用基因工程手段培育出對瘋牛病具有免疫力的牛,這種轉(zhuǎn)基因牛不攜帶普里昂蛋白或其他傳染性蛋白。

2005年,Donovan等將編碼溶葡球菌酶的基因轉(zhuǎn)入奶牛基因組中獲得轉(zhuǎn)基因牛,證明在其乳腺中表達(dá)的溶葡球菌酶可以有效預(yù)防由葡萄球菌引起的乳房炎,轉(zhuǎn)基因牛葡萄球菌感染率僅為14%,而非轉(zhuǎn)基因牛感染率達(dá)71%。

2006年,萊陽農(nóng)學(xué)院董雅娟等與日木山口大學(xué)合作,成功地培育出2頭轉(zhuǎn)有抗瘋牛病基因的轉(zhuǎn)基因奶牛。2007年,該研究組的Richt等通過基因打靶技術(shù)將牛的PRNP基因雙位點滅活,獲得了存活兩年以上的轉(zhuǎn)基因牛[23]。這些牛在臨床解剖、生理發(fā)育、組織病理以及免疫和生殖發(fā)育方而都很正常,而且在體外試驗中能夠很好的抵抗瘋牛病的傳染,這為生產(chǎn)不含骯蛋白的肉、奶制品提供了一種很好的方法。

4.4 改良品種

轉(zhuǎn)基因技術(shù)可用于改造動物的基因組,提高家畜的經(jīng)濟(jì)性狀,如加快生長速度、提高瘦肉率,改善肉質(zhì),提高飼料利用率和抗病力等。轉(zhuǎn)基因技術(shù)用于育種,不僅可以加快改良進(jìn)程,提高選擇效率,而且不會受到有性繁殖的局限。

2003年,Brophy等研究人員在奶牛的胚胎細(xì)胞中加入了兩種額外的基因:β-酪蛋白和κ-酪蛋白,由此培育的轉(zhuǎn)基因奶牛所產(chǎn)的奶中β-酪蛋白含量提高了20%,κ-酪蛋白的含量也增加了一倍。

人們利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)把有利基因轉(zhuǎn)移到肉牛中,使肉牛帶有外源基因,且能夠在后代中表達(dá)出來,對肉牛業(yè)的發(fā)展和人們生活水平的提高有重要作用。

5 問題與展望

現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用主要集中在醫(yī)藥方面,在食品工業(yè)上的應(yīng)用很有限,主要原因是轉(zhuǎn)基因的效率太低,建立優(yōu)質(zhì)轉(zhuǎn)基因動物品系的時間太長。今后的工作還應(yīng)集中在現(xiàn)有的技術(shù)水平上建立更加簡便、經(jīng)濟(jì)、有效的轉(zhuǎn)基因技術(shù),制備出外源基因穩(wěn)定遺傳的有生產(chǎn)應(yīng)用價值的健康動物。隨著家畜基因組計劃的完成,人類將更有針對性地改良家畜基因,把外源基因插入到對動物生長影響較小的DNA片段中,從而克服隨機(jī)整合和異常表達(dá)給家畜健康帶來的問題,而基因打靶等新的轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)造了這種可能。

2008年7月,國務(wù)院常務(wù)會議審議并原則通過了轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項,投入資金約200億元,轉(zhuǎn)基因動物新品種培育已經(jīng)得到了我國政府的高度重視。轉(zhuǎn)基因動物的研究和應(yīng)用將是21世紀(jì)生物工程技術(shù)領(lǐng)域最活躍、最具有應(yīng)用價值的項目之一。它將給人類的醫(yī)藥衛(wèi)生、生物材料、家畜改良等領(lǐng)域帶來革命性的變化,它所帶來的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益將是難以估量的。

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Current Status of Transgenic animals and Application in Transgenic Cattle Breeding

HUANG Yong-zhen,HE Hua,CHEN Hong＊

(Co llege of Animal S cience and Technolo gy,North west A&F University,Yang ling,S haan xi 712100,China)

Transgenic animals have been applied to all areas of life sciences.It has comprehensive application especially in the bioreactor,drug screening,xenotransplantation,improved varieties and improved production performance of animals and other aspects.In this paper,w e described the history of the transgenic technology and the state of the development,severaltraditionalm ethods of transgenic technology was introduced,some new transgenic technologies of focus on improve transgenic efficiency and precise control in recent years.In addition,research status of transgenic technology in cattle breeding and the application and development prospect of cultivate new varieties by transgenic technology in cattle breeding and biopharmaceuticalapplication and prospect and other fields of research in the future.

Transgenic Animals;Transgenic Efficiency;Precise Controlof Transgenic

S823.2

A

1001-9111(2011)04-0035-06

2011-03-15

2011-04-09

本研究由國家自然科學(xué)基金(編號:30972080);國家科技支撐計劃(編號:2008BADB2B03-19);農(nóng)業(yè)部肉牛產(chǎn)業(yè)體系項目(編號:CARS-38);國家轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ椬诱n題(編號:2009ZX08009-157B,2008ZX08007-002,2009ZX08007-005B-07)項目資助。

黃永震(1983-),男,河南南陽人,博士研究生,主要從事動物遺傳育種與繁殖研究。

＊通訊作者:陳 宏(1955-),男,陜西西安人,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事分子遺傳與家畜育種。