薄祿龍 王嘉鋒 鄧小明上海長海醫(yī)院麻醉科

膿毒癥（sepsis)是臨床危重患者死亡的重要原因之一，涉及感染、炎癥、免疫、凝血及組織損傷的多病理過程，表現(xiàn)為復(fù)雜的免疫反應(yīng)過程。隨著危重病治療技術(shù)的進(jìn)展，大多膿毒癥患者能度過促炎反應(yīng)期，進(jìn)入持久的免疫抑制期[1]。膿毒癥導(dǎo)致的免疫抑制是當(dāng)前膿毒癥患者死亡的主要原因之一[2]。負(fù)性共刺激分子，作為免疫細(xì)胞表面一類負(fù)性調(diào)控細(xì)胞功能的蛋白，可能在膿毒癥免疫抑制中發(fā)揮重要作用。因此，深入探索膿毒癥免疫抑制的分子機(jī)制，特別是負(fù)性共刺激分子在其中扮演的角色，是當(dāng)前膿毒癥研究的熱點(diǎn)問題之一，也將為膿毒癥的免疫調(diào)理治療提供新的方向[3]。

1 膿毒癥免疫抑制

近十年來，逾25項膿毒癥大規(guī)模臨床藥物試驗(yàn)以失敗告終。2011年10月，期待已久的PROWESS研究表明，活化蛋白C并不顯著降低膿毒癥患者28天病死率，美國Eli Lilly公司隨即宣布從市場撤除活化蛋白C（Xigris）[4]。這意味著，進(jìn)入新世紀(jì)來首個被證實(shí)治療膿毒癥的有效藥物已成明日黃花。基礎(chǔ)研究者與臨床醫(yī)師不得不重新思考膿毒癥這一棘手難題。首先，膿毒癥病理生理機(jī)制錯綜復(fù)雜，在其機(jī)制研究上業(yè)已積累的累累碩果是否陷入某種誤區(qū)？其次，現(xiàn)有診斷與指標(biāo)評價體系應(yīng)用于膿毒癥藥物試驗(yàn)是否恰當(dāng)？最后，在審慎思考了前兩個問題后，研究者接下來該走向何方[5]？

膿毒癥早期以促炎反應(yīng)為主，其反應(yīng)強(qiáng)度與病原體種類、數(shù)量、毒力及患者并存疾病等密切相關(guān)。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，炎癥細(xì)胞過度激活和介質(zhì)釋放是膿毒癥導(dǎo)致臟器損傷的主要原因。循證醫(yī)學(xué)證據(jù)提示，可顯著改善膿毒癥預(yù)后的主要措施是早期目標(biāo)化治療、肺保護(hù)性通氣策略、嚴(yán)格控制血糖、小劑量糖皮質(zhì)激素等。上述措施可一定程度上降低膿毒癥患者病死率，仍不能根本性改善膿毒癥及其后續(xù)并發(fā)癥的預(yù)后，且存在某些相關(guān)風(fēng)險或并發(fā)癥[6-7]。

近年研究認(rèn)為，膿毒癥的發(fā)生與病程進(jìn)展，不單純是病原體及其毒素導(dǎo)致的炎癥損害，還存在免疫功能紊亂，主要表現(xiàn)免疫抑制。學(xué)界提出的假說認(rèn)為，早期的炎癥高反應(yīng)期可誘導(dǎo)機(jī)體進(jìn)入炎癥低反應(yīng)期，出現(xiàn)免疫抑制。換言之，隨病情進(jìn)展，膿毒癥患者常由全身炎癥免疫亢進(jìn)期進(jìn)入免疫抑制期，機(jī)體出現(xiàn)免疫功能低下、免疫抑制或免疫癱瘓，同時發(fā)生頑固性繼發(fā)性細(xì)菌、病毒或真菌感染，且多為非條件致病微生物[8]。近期，一項近千例膿毒癥患者回顧性分析結(jié)果認(rèn)為，膿毒癥患者極易感染條件性致病微生物，導(dǎo)致死亡率增加[9]。

2 膿毒癥免疫調(diào)理治療的現(xiàn)狀

學(xué)界曾提出數(shù)項針對性的免疫療法，旨在增強(qiáng)促炎反應(yīng)或誘導(dǎo)自身免疫，以達(dá)到降低膿毒癥病死率的目的。遺憾的是，部分在Ⅰ期或Ⅱ期臨床研究中具有確證療效的藥物或療法，均止步于Ⅲ期臨床試驗(yàn)。其失敗原因是多方面的，如膿毒癥所致免疫抑制程度較重，單純的增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)或誘導(dǎo)促炎反應(yīng)很難奏效。其次，有學(xué)者認(rèn)為，膿毒癥的免疫調(diào)理治療若未確切評估患者免疫抑制狀態(tài)，進(jìn)行選擇性的個體化用藥，將難以改變膿毒癥治療現(xiàn)狀[10]。

單核巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）具有潛在免疫刺激效應(yīng)，可促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的存活、增殖分化與吞噬殺菌能力，改善中性粒細(xì)胞的遷移與黏附能力。2009年，Meisel等就GM-CSF對膿毒性休克患者免疫抑制狀態(tài)的影響進(jìn)行了一項多中心RCT研究[11]。結(jié)果表明，對于單核細(xì)胞HLA-DR水平連續(xù)兩次低于8 000個單克隆抗體/細(xì)胞的患者，應(yīng)用4 μg/（kg d）的GM-CSF治療持續(xù)5 d，可顯著改善膿毒性休克患者單核細(xì)胞HLA-DR恢復(fù)至正常水平。與生理鹽水對照組相比，GM-CSF治療組患者機(jī)械通氣時間減少，APACHEⅡ評分降低，ICU住院天數(shù)、總住院天數(shù)有所減少（但無統(tǒng)計學(xué)差異）。該研究結(jié)論認(rèn)為，GM-CSF具有改善膿毒性休克患者預(yù)后的趨勢，其GM-CSF是否降低其病死率需要進(jìn)一步大規(guī)模臨床RCT予以驗(yàn)證。

為系統(tǒng)評價集落細(xì)胞刺激因子在膿毒癥中的治療價值，我們系統(tǒng)檢索了PubMed、EMBASE、Cochrane Central Register of Controlled Trials數(shù)據(jù)庫（截至2010年11月），最終納入12項應(yīng)用G-CSF或GM-CSF治療膿毒癥的RCT，共計2 380例患者。結(jié)果表明，G-CSF或GM-CSF可有效逆轉(zhuǎn)膿毒癥患者的感染狀態(tài)，卻不顯著降低膿毒癥患者14 d或28 d死亡率、住院死亡率?？傊F(xiàn)有循證醫(yī)學(xué)證據(jù)尚不支持將G-CSF或GM-CSF常規(guī)應(yīng)用于膿毒癥患者治療[12]。

不過，我們的研究不乏局限性，主要表現(xiàn)為納入的各項RCT異質(zhì)性較高，患者一般狀況不統(tǒng)一，基線水平不一，研究質(zhì)量參差不齊，G-CSF或GM-CSF應(yīng)用時機(jī)與劑量也難以統(tǒng)一。更重要的是，既往此類研究多未事先確定患者免疫狀態(tài)。因此，只有在確定膿毒癥免疫抑制狀態(tài)的基礎(chǔ)上，再給予免疫調(diào)理治療，或能有效地改善患者預(yù)后[13]。除前述提及的單核細(xì)胞HLA-DR可定量評估患者免疫狀態(tài)外，近年來新發(fā)現(xiàn)并備受關(guān)注的負(fù)性共刺激分子也有助于膿毒癥患者免疫狀態(tài)的評價與分層。

3 膿毒癥免疫抑制的可能原因與機(jī)制

顯而易見，膿毒癥猶如一場競速賽，對壘雙方為病原微生物與機(jī)體免疫系統(tǒng)。病原微生物通過多途徑誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡，抑制MHC Ⅱ類分子表達(dá)，促進(jìn)負(fù)性共刺激分子表達(dá)和抑炎細(xì)胞因子分泌，增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）與骨髓源性抑制細(xì)胞（MDSC）的數(shù)量。

盡管針對膿毒癥免疫抑制的研究為數(shù)甚多，但其確切機(jī)制仍未闡明。膿毒癥免疫抑制時，固有免疫和獲得性免疫系統(tǒng)反應(yīng)均受損害，出現(xiàn)多種免疫細(xì)胞凋亡，T細(xì)胞增殖能力受抑制，T細(xì)胞分化由Th1向Th2轉(zhuǎn)化，遲發(fā)型超敏反應(yīng)能力降低，抗原遞呈細(xì)胞功能減低等。

單核巨噬細(xì)胞功能發(fā)生顯著改變，對細(xì)胞免疫功能產(chǎn)生廣泛影響。巨噬細(xì)胞吞噬功能受損，其細(xì)胞因子譜分泌改變，表達(dá)MHCⅡ類分子及正性共刺激分子能力下降；單核細(xì)胞“鈍化”，表現(xiàn)為細(xì)胞表面HLA-Ⅱ類抗原表達(dá)減少。

臨床觀察和動物研究均證實(shí)，膿毒癥時存在T細(xì)胞反應(yīng)性降低或無能。機(jī)體經(jīng)歷嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷后，細(xì)胞因子分泌能力受抑，T細(xì)胞對特異性抗原刺激無增殖反應(yīng)，外周血效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)目減少，其被認(rèn)為與膿毒癥患者死亡率增加有關(guān)。凋亡的T細(xì)胞進(jìn)一步誘導(dǎo)免疫細(xì)胞無反應(yīng)性，導(dǎo)致抑炎細(xì)胞因子分泌增加，嚴(yán)重?fù)p害免疫系統(tǒng)對病原的反應(yīng)與清除能力。此外，抗原遞呈細(xì)胞也發(fā)生凋亡，使機(jī)體無法對病原產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。

除此之外，免疫細(xì)胞上的負(fù)性共刺激分子表達(dá)上調(diào)，也可能參與了膿毒癥的免疫抑制過程，如程序性死亡受體-1（PD-1）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4（CTLA-4）等。2011年12月，美國Hotchkiss RS研究組在JAMA發(fā)表一項臨床研究[14]。研究者利用流式細(xì)胞術(shù)、免疫組織化學(xué)等技術(shù)通過尸檢40例因重癥膿毒癥死亡患者的肺臟、脾臟等器官，系統(tǒng)地描述了這些患者的免疫抑制表現(xiàn)。與肺癌死亡患者或正常的器官供體相比，膿毒癥患者多種負(fù)性共刺激分子（PD-1、PD-L1、CTLA-4、BTLA）表達(dá)水平上調(diào)，脾臟內(nèi)皮細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)水平顯著上調(diào)，氣道上皮細(xì)胞皰疹病毒進(jìn)入介質(zhì)（HVEM）顯著增高，免疫抑制細(xì)胞數(shù)量增加。換言之，這些膿毒癥患者死亡前呈現(xiàn)顯著的免疫抑制狀態(tài)，提示如果針對性免疫增強(qiáng)療法，可能有助于改善膿毒癥免疫抑制患者的預(yù)后。

4 負(fù)性共刺激分子在膿毒癥中的研究進(jìn)展

免疫應(yīng)答過程中，充分活化T細(xì)胞需要雙信號識別，除特異性抗原肽/TCR組成的第一信號外，還需要多種共刺激分子參與提供第二信號。第二信號的缺乏，會導(dǎo)致T細(xì)胞的無反應(yīng)性或特異性免疫耐受；相反，若共刺激信號反應(yīng)過度則可能導(dǎo)致免疫細(xì)胞異常激活，從而引發(fā)各種自身免疫性疾病。

第二信號無抗原特異性，但有正、負(fù)性之分。正性共刺激分子主要包括B7/CD28、OX40/OX40L、4-1BB/4-1BBL、HVEM/LIGHT等，負(fù)性共刺激分子主要包括PD-1、BTLA、CTLA-4、Tim-3、LAG-3及其相應(yīng)配體。正性共刺激分子促進(jìn)T細(xì)胞增殖與分化，分泌效應(yīng)細(xì)胞因子；負(fù)性共刺激分子的表達(dá)則抑制T細(xì)胞活化，對外周免疫耐受的形成發(fā)揮關(guān)鍵性作用[15]。

共刺激分子參與免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)，以使免疫系統(tǒng)適時開啟或終止，抵抗外來病原入侵，防止自身免疫性疾病的發(fā)生。早期關(guān)于T細(xì)胞活化第二信號的研究，主要集中于正性共刺激分子對免疫系統(tǒng)活化的調(diào)控作用。越來越多的研究表明，免疫反應(yīng)過程中任何一種信號通路均有正性和負(fù)性共刺激分子的參與，負(fù)性共刺激分子對免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制日漸受到關(guān)注。

4.1 PD-1/PD-L1

程序性死亡受體1 （programmed death-1，PD-1，CD279） 屬于B7-CD28超家族，于1992年由Ishida等首次分離并命名。PD-1是一個55kD的I型跨膜糖蛋白，其在胞漿區(qū)的尾部含有兩個酪氨酸殘基，N端酪氨酸殘基參與構(gòu)成一個免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM），C端參與構(gòu)成一個免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序（ITSM）。人PD-1基因的染色體定位為2q37.3，編碼288個氨基酸的蛋白質(zhì)[16]。

PD-1可表達(dá)于人T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（DC）及活化的單核細(xì)胞。通常，PD-1主要誘導(dǎo)性表達(dá)于活化的CD4+、CD8+T細(xì)胞，在靜止期T細(xì)胞上不表達(dá)；小鼠胸腺、脾臟、淋巴結(jié)和骨髓等淋巴組織中，PD-1呈低水平表達(dá)，當(dāng)T、B細(xì)胞受刺激后可誘導(dǎo)性表達(dá)PD-1。PD-1有兩個配體，分別是PD-L1（B7-H1，CD274）和PD-L2（B7-DC，CD273）。PD-L1在人體又稱為B7-H1，廣泛表達(dá)于B細(xì)胞、DC、單核巨噬細(xì)胞及骨髓源性肥大細(xì)胞等。PD-L1也廣泛表達(dá)于非淋巴組織中，如血管內(nèi)皮細(xì)胞、胰島細(xì)胞、星狀細(xì)胞、角蛋白細(xì)胞等。PD-L2僅誘導(dǎo)性表達(dá)于DC、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞表面[17]。

當(dāng)PD-1與其主要配體PD-L1結(jié)合時，ITSM發(fā)生去磷酸化，從而發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。PD-1胞內(nèi)區(qū)C端ITSM中的酪氨酸殘基招募SHP-2，后者使TCR附近的信號分子去磷酸化而失活，從而減弱T細(xì)胞活化所需的TCR/CD28信號。換言之，PD-1/PD-L1通路可能在外周器官里也可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答反應(yīng)[18]。

PD-1/PD-L1通路的激活可抑制Th1細(xì)胞增殖，減少IFN-γ和Th1型細(xì)胞因子分泌，影響Th1/Th2分化。當(dāng)活化的T細(xì)胞PD-1表達(dá)上調(diào)時，Treg的免疫抑制作用受PD-1調(diào)控，當(dāng)給予抗PD-L1抗體后，Treg的免疫抑制作用終止。這意味著，PD-1/PD-L1通路對Treg發(fā)揮抑制作用必不可少。

PD-1/PD-L1通路在免疫逃逸、腫瘤免疫耐受和自身免疫性疾病中的作用有較多的研究。已有多項研究表明，PD-1/PD-L1在感染免疫特別是膿毒癥中發(fā)揮著重要的作用。2009年，Huang等研究證實(shí)，PD-1-/-膿毒癥小鼠生存率顯著高于野生型小鼠，表現(xiàn)為腹腔細(xì)菌清除率升高，促炎細(xì)胞因子水平降低等。在野生型膿毒癥小鼠模型，其腹腔巨噬細(xì)胞表面PD-1顯著增高；當(dāng)去除PD-1-/-膿毒癥小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后，小鼠清除細(xì)菌能力降低，小鼠炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，對膿毒癥抵抗力降低[19]。總之，PD-1不僅可作為單核巨噬細(xì)胞功能障礙的標(biāo)志，還有望成為膿毒癥治療的新靶點(diǎn)。

2010年，Brahmamdam等的研究顯示，抗PD-1抗體可提高膿毒癥小鼠生存率，預(yù)防膿毒癥誘導(dǎo)的T細(xì)胞與DC凋亡耗竭，并促進(jìn)凋亡抑制基因（Bcl-xL）的表達(dá)[20]。我們課題組的動物的研究表明，膿毒癥小鼠T細(xì)胞、B細(xì)胞及單核細(xì)胞上PD-1和PD-L1表達(dá)均上調(diào)，給予PD-L1阻斷性抗體可降低膿毒癥小鼠死亡率，提高膿毒癥小鼠腹腔細(xì)菌清除率，抑制淋巴細(xì)胞凋亡，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子TNF-α與IL-6的分泌，減少抑炎細(xì)胞因子IL-10的分泌[21]。

2011年，我們課題組的臨床研究發(fā)現(xiàn)，膿毒性休克患者（19例）外周血淋巴細(xì)胞顯著凋亡，外周血T細(xì)胞PD-1和單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)均上調(diào)。通過體外培養(yǎng)膿毒性休克患者外周血T細(xì)胞與單核細(xì)胞，并給予抗PD-L1抗體，結(jié)果表明阻斷PD-1/PD-L1通路可抑制T細(xì)胞凋亡，促進(jìn)單核細(xì)胞分泌IL-6而減少IL-10分泌[22]。隨后，Guignant等研究則進(jìn)一步驗(yàn)證了我們的研究結(jié)果[23]。他們的研究顯示，膿毒性休克患者（64例）單核細(xì)胞PD-1、PD-L1及PD-L2表達(dá)水平升高，PD-1及PD-Ls的表達(dá)水平與膿毒性休克患者的繼發(fā)性感染、病死率相關(guān)。

綜合分析看，膿毒癥患者和小鼠模型外周血單核細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平顯著上調(diào)，膿毒癥小鼠腹腔巨噬細(xì)胞PD-1表達(dá)顯著上調(diào)。上述研究提示，PD-1/PD-L1通路在膿毒癥免疫抑制中發(fā)揮重要作用。無論是特異性阻斷PD-1還是PD-L1，都可增強(qiáng)CD4+、CD8+T細(xì)胞增殖能力，抑制其凋亡。調(diào)控負(fù)性共刺激分子PD-1及其主要配體PD-L1的表達(dá)，將可能為膿毒癥治療提供新的靶點(diǎn)[24]。

4.2 CTLA-4

細(xì)胞毒T細(xì)胞相關(guān)抗原-4（cytotoxic T lymphocyteassociated antigen-4，CTLA-4，CD152）屬于屬于B7-CD28家族，與CD28 有70%的同源性。1987年，Brunet等在篩選小鼠殺傷性T細(xì)胞cDNA文庫時發(fā)現(xiàn)了CTLA-4基因并命名[25]。

CTLA-4僅表達(dá)于活化T細(xì)胞表面，在T細(xì)胞活化后迅速上調(diào)，一般在T細(xì)胞活化后的48h達(dá)到高峰，表達(dá)量只有CD28的2%~3%。B7-1和 B7-2是 CTLA-4的天然配體，又分別稱為CD80和CD86，均為免疫球蛋白家族成員的跨膜糖蛋白。CTLA-4在胞漿內(nèi)含有ITIM功能區(qū)，與B7-1/B7-2結(jié)合后可抑制T細(xì)胞的活化，降低IL-2的產(chǎn)生，使T細(xì)胞增殖活化受到抑制，保持外周免疫平衡[26]。

CTLA-4的一大特點(diǎn)是，只需較少的量即可發(fā)揮強(qiáng)大的免疫抑制功能。其原因可能是，CTLA-4與B7的親和力是正性共刺激分子CD28的數(shù)十倍。在T細(xì)胞活化后，CTLA-4與CD28競爭結(jié)合B7分子，易形成B7-CTLA-4抑制信號復(fù)合物，從而抑制T細(xì)胞活化，促進(jìn)免疫抑制形成。這意味著，阻斷CTLA-4發(fā)揮生物學(xué)功能，將可能在自身免疫疾病、腫瘤及感染性疾病的治療中，具有重要價值[27]。

我們課題組的研究發(fā)現(xiàn)，CLP小鼠術(shù)后CTLA-4陽性CD4+、CD8+T細(xì)胞比例顯著增高，CTLA-4陽性Treg比例及其平均熒光強(qiáng)度也增高?？笴TLA-4抗體可顯著提高CLP膿毒癥小鼠和CLP+白念珠菌感染膿毒癥小鼠的生存率?？笴TLA-4抗體可顯著降低CLP膿毒癥小鼠Caspase-3陽性CD4+、CD8+T細(xì)胞比例，而對細(xì)胞因子表達(dá)以及T細(xì)胞亞群比例無顯著影響。換句話說，抗CTLA-4抗體對膿毒癥小鼠的治療作用可能是通過抑制細(xì)胞凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的[28]。

值得關(guān)注的是，我們的研究發(fā)現(xiàn)抗CTLA-4抗體僅在小劑量時對膿毒癥小鼠產(chǎn)生保護(hù)作用；當(dāng)加大抗CTLA-4抗體劑量后，膿毒癥小鼠死亡率反而升高。其可能原因是大劑量抗CTLA-4抗體可能導(dǎo)致淋巴細(xì)胞過度激活，進(jìn)而導(dǎo)致小鼠死亡。這也從側(cè)面說明，膿毒癥時機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)與平衡是一個動態(tài)過程，過猶不及，需適當(dāng)調(diào)節(jié)。

Johanns 等的研究認(rèn)為，高表達(dá)CTLA-4的Treg可抑制小鼠清除沙門氏菌的能力。此外，Treg表達(dá)CTLA-4的水平與其對機(jī)體的免疫抑制功能呈對應(yīng)關(guān)系，清除此類Treg有助于小鼠提高對沙門氏菌的抵抗能力[29]。因此，CTLA-4介導(dǎo)Treg發(fā)揮免疫抑制功能，在機(jī)體清除特異病原過程中發(fā)揮重要作用。

此外，CTLA-4是Treg表面一類重要的介導(dǎo)接觸抑制的膜分子蛋白。膿毒癥時Treg的數(shù)量顯著增加，并參與膿毒癥的免疫抑制。Treg可介導(dǎo)Th1反應(yīng)向Th2反應(yīng)漂移，抑制Th1輔助的CD8+T 細(xì)胞分化與成熟。因此，膿毒癥時CTLA-4對Treg表型及功能的調(diào)節(jié)作用，值得進(jìn)一步研究。

4.3 BTLA

B、T淋巴細(xì)胞衰減因子（B and T lymphocyte attenuator，BTLA，CD272），是繼CTLA-4和PD-1之后鑒定出的一個新的負(fù)性共刺激分子，于2003年由Murphy等首次鑒定并命名。BTLA具有一個IgV胞外功能區(qū)，胞漿區(qū)有ITIM和ITSM基序，當(dāng)胞內(nèi)功能區(qū)被磷酸化時可招募SHP-1和SHP-2，這可能是BTLA與其配體結(jié)合發(fā)揮免疫抑制作用的關(guān)鍵因素[30]。

BTLA主要表達(dá)在T和B淋巴細(xì)胞表面，在巨噬細(xì)胞、骨髓源性DC和NK細(xì)胞表面也有表達(dá)；在骨髓內(nèi)，原B細(xì)胞及前B細(xì)胞階段的B細(xì)胞上，BTLA呈低豐度表達(dá)，而在未成熟的B細(xì)胞上BTLA表達(dá)水平較高。在外周血，大部分CD4+T、CD8+T細(xì)胞均持續(xù)低水平表達(dá)BTLA。

最初認(rèn)為，BTLA的配體應(yīng)該是B7x新成員，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)BTLA并不與B7x直接結(jié)合，HVEM可能是BTLA唯一的配體。HVEM表達(dá)于靜止期T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和未成熟的DC上。BTLA與HVEM結(jié)合可產(chǎn)生抑制信號，下調(diào)B、T淋巴細(xì)胞活性。大量實(shí)驗(yàn)表明，BTLA可抑制CD3+T細(xì)胞的活化與增值，抑制IL-2和IFN-γ的分泌，下調(diào)T細(xì)胞免疫應(yīng)答[31]。

BTLA-/-或HVEM-/-小鼠抵抗李斯特菌感染能力增強(qiáng)，機(jī)體促炎細(xì)胞因子分泌增加，BTLA-HVEM激活可抑制李斯特菌感染的初始免疫反應(yīng)，預(yù)防膿毒性休克和炎性風(fēng)暴的發(fā)生[32]。BTLA-HVEM激活可減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)和抑制排斥；BTLA在維持自身免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[33]。

BTLA與PD-1、CTLA-4具有相似的結(jié)構(gòu)，但其表達(dá)特點(diǎn)有所不同。PD-1、CTLA-4在靜止期T細(xì)胞上不表達(dá)，T細(xì)胞活化后其表達(dá)逐步升高，而BTLA在靜止期T細(xì)胞上呈組成性表達(dá)，活化后繼續(xù)表達(dá)。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組小鼠相比，CLP膿毒癥小鼠BTLA+ B細(xì)胞比例未見顯著變化，脾臟內(nèi)幾乎全部的B細(xì)胞表面均有BTLA表達(dá)，但BTLA在B細(xì)胞上的平均熒光強(qiáng)度升高約1.5倍，抗BTLA抗體可抑制其表達(dá)；CLP膿毒癥小鼠CD4+、CD8+T細(xì)胞表面BTLA表達(dá)水平升高，BTLA+CD4+T細(xì)胞數(shù)量未見顯著變化，BTLA+CD8+T細(xì)胞數(shù)量顯著增加。與野生型膿毒癥小鼠相比，BTLA-/-膿毒癥小鼠生存率未見改善，抗BTLA抗體亦未顯著降低野生型膿毒癥小鼠死亡率（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。

美國Ayala A教授研究組，以58例中重度燒傷患者和10例健康成人為研究對象，發(fā)現(xiàn)燒傷患者外周血CD4+ T細(xì)胞表面BTLA表達(dá)水平升高（88.9% vs.37.7%；P<0.000 1）。研究者認(rèn)為，燒創(chuàng)傷容易合并免疫抑制，監(jiān)測BTLA表達(dá)水平與創(chuàng)傷患者病情嚴(yán)重程度、繼發(fā)感染與并發(fā)癥的關(guān)系，將有助于進(jìn)一步揭示BTLA的作用?？傊?，BTLA在膿毒癥中的作用值得更深入的研究。

4.4 Tim-3

Tim-3是T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子（T cell immunoglobulin and mucin domain， Tim）家族成員。Tim是2001年Mclntire等在研究哮喘基因時發(fā)現(xiàn)的新基因家族。目前，已在嚙齒類動物體內(nèi)鑒別出8個Tim家族成員，包括Tim-1～Tim-8，人類Tim基因家族位于染色體5q33.3，包括Tim-1、Tim-3和Tim-4[34]。

Tim-3為I型跨膜蛋白，其細(xì)胞外區(qū)含有免疫球蛋白V區(qū)，由31%絲氨酸和絲氨酸殘基組成的黏蛋白區(qū)，胞漿區(qū)含有6個酪氨酸，其中一個屬于酪氨酸磷酸化基序（RSEENIY）。早期研究認(rèn)為，Tim-3表達(dá)較為局限，僅特異性表達(dá)于分化終末期的Th1細(xì)胞上，在Th2細(xì)胞不表達(dá)。近來研究提示，Tim-3也表達(dá)于活化的CD8+T、Th17、Treg、單核巨噬細(xì)胞、DC與肥大細(xì)胞上。值得注意的是，Tim-3在不同的適應(yīng)性免疫細(xì)胞和固有免疫細(xì)胞上，其表達(dá)水平與功能不盡相同[35]。

Tim-3的配體為半乳糖凝集素-9（Galectin-9），廣泛表達(dá)于人及嚙齒類動物脾臟與淋巴組織中，以巨噬細(xì)胞、Treg細(xì)胞為主。Tim-3與Galectin-9結(jié)合，向T細(xì)胞提供負(fù)性共刺激信號，抑制Th1免疫反應(yīng)，導(dǎo)致Th1型細(xì)胞凋亡，抑制IFN-γ的分泌。Tim-3可誘導(dǎo)負(fù)性信號，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的活化與功能。目前，有關(guān)Tim-3的研究進(jìn)展迅速，已基本闡明其基因、蛋白結(jié)構(gòu)，初步明確了Tim-3與配體相互作用的途徑與生物學(xué)效應(yīng)。

Tim-3在固有免疫細(xì)胞上的表達(dá)，已被證實(shí)參與調(diào)控病毒性肝炎、腫瘤、移植排斥等疾病病理過程。Tim-3/Galectin-9通路可負(fù)性調(diào)控Th1免疫反應(yīng)。動物模型和人類基因數(shù)據(jù)也提示，Tim-3位點(diǎn)的基因多態(tài)性與哮喘、糖尿病、多發(fā)性硬化及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等相關(guān)[36]。

隨著Treg、Th17細(xì)胞在感染免疫中作用的凸顯，Tim-3在此類細(xì)胞的表達(dá)與功能調(diào)控，及其在膿毒癥中的作用有待進(jìn)一步闡明。盡管Tim-3參與細(xì)胞凋亡，但其對凋亡的調(diào)控與膿毒癥的關(guān)系尚不完全清楚，進(jìn)一步深入研究Tim-3對膿毒癥免疫抑制期免疫細(xì)胞凋的調(diào)控機(jī)制，將有助于進(jìn)一步闡明膿毒癥病理生理機(jī)制。

4.5 LAG-3

淋巴細(xì)胞活化基因3 （lymphocyte activation gene 3，LAG-3，CD223）是免疫球蛋白超家族成員之一。LAG-3是一種跨膜糖蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)三個部分組成。成熟的LAG-3由470個氨基酸構(gòu)成，1990年由Triebel等首次發(fā)現(xiàn)[37]。

LAG-3主要表達(dá)于活化的CD4+T、CD8+T細(xì)胞。新近研究發(fā)現(xiàn)，LAG-3還可表達(dá)與漿細(xì)胞樣DC，其表達(dá)水平比活化T細(xì)胞高數(shù)倍。LAG-3與CD4分子具有較高的相似性，可與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合，功能卻截然相反。LAG-3是TCR的共受體組成部分之一，參與TCR激活反應(yīng)，可增強(qiáng)Treg的抑制活性，對非Treg的增殖和功能發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用，從而在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[37]。

LAG-3可負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞擴(kuò)增，控制記憶性T細(xì)胞池。阻斷LAG-3與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合，可增加T細(xì)胞活化抗原CD69的表達(dá)，恢復(fù)細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌能力。LAG-3對Treg細(xì)胞的抑制功能具有直接調(diào)節(jié)作用，是Treg行使功能的必需分子。阻斷LAG-3可消除Treg的抑制功能。這意味著，阻斷LAG-3不但有可能顯著改善膿毒癥免疫抑制時T細(xì)胞功能，還可降低Treg的免疫抑制活性，糾正機(jī)體免疫抑制狀態(tài)。

可溶性LAG-3（sLAG-3）蛋白，其有增強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的功能。業(yè)已明確，sLAG-3 Ig融合蛋白可誘導(dǎo)DC成熟活化，刺激T細(xì)胞應(yīng)答，可作為有效的免疫促進(jìn)劑。在腫瘤研究中，sLAG-3 Ig融合蛋白可作為疫苗佐劑，導(dǎo)致抗原或抗原特異性免疫應(yīng)答能力增強(qiáng)，改善荷瘤動物存活率與生存時間。在小鼠自體抗原耐受模型上，無功能的CD8+T細(xì)胞既表達(dá)LAG-3又表達(dá)PD-1[38]。這很可能意味著，T細(xì)胞的無能或耗竭，極有很可能是幾個負(fù)性共刺激分子同時發(fā)揮作用，且為協(xié)同作用。總之，LAG-3在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，為腫瘤、結(jié)核及自身免疫性疾病的免疫治療提供了新的靶點(diǎn)[39]。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者和小鼠DC和CD4+T細(xì)胞LAG-3表達(dá)顯著上調(diào)，且LAG3表達(dá)與PD-1水平線性相關(guān)。進(jìn)一步研究顯示，抗LAG-3抗體可減輕膿毒癥小鼠淋巴細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)菌清除率，提高膿毒癥小鼠存活率（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。換言之，LAG3在膿毒癥，特別是免疫細(xì)胞凋亡的調(diào)控中可能發(fā)揮重要作用。

5 總結(jié)

共抑制分子抑制免疫系統(tǒng)應(yīng)答在膿毒癥及腫瘤、自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。機(jī)體免疫系統(tǒng)錯綜復(fù)雜，負(fù)性共刺激分子無疑為人們管窺其中奧秘開啟了一扇精巧的“側(cè)門”。然而，阻斷負(fù)性共刺激分子，尋找潛在有效的免疫調(diào)理治療策略，并真正應(yīng)用到臨床依然有許多問題尚待解決。例如，尚需深入研究PD-1/PD-L1與B7-CD28家族其他成員（如BTLA、CTLA-4）是否產(chǎn)生協(xié)同作用。更重要的是，機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)十分復(fù)雜，各類細(xì)胞因子與表面受體的功能相互調(diào)控，對某一負(fù)性共刺激信號的阻斷，其安全性與有效性尚待進(jìn)一步評價。尤需注意的問題還包括，現(xiàn)有關(guān)于負(fù)性共刺激分子與膿毒癥的研究多為動物或離體實(shí)驗(yàn)。用于制造膿毒癥模型的動物，多處于青壯年期，亦無合并癥；而臨床膿毒癥多好發(fā)于老年患者，常合并多種疾病，研究者應(yīng)注意其中的差別。

總之，負(fù)性共刺激分子為膿毒癥的治療帶來了新的曙光，并有望成為膿毒癥免疫調(diào)理治療的新靶點(diǎn)，負(fù)性共刺激分子調(diào)控膿毒癥免疫抑制的具體機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

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