邱惠國 林暉 侯喜琴 趙軍 宋秀宇

染色體G顯帶是研究細胞遺傳學的基礎，被廣泛地用于基礎醫(yī)學、臨床醫(yī)學的研究和染色體病的確診。整個制片過程繁瑣，經(jīng)歷時間較長，任何一個步驟操作不當，均可影響染色體標本制備的最終效果。經(jīng)過3500多份標本的制備，我們總結了一些經(jīng)驗。

1 染色體G顯帶玻片的制作

1.1 取血與接種時間 一次性真空采血肝素抗凝管(3 ml規(guī)格)，常規(guī)消毒肘部皮膚及抗凝管的進針處，抽取靜脈血2～3 ml，輕輕搖勻，防止凝固，待接種培養(yǎng)。當天不能培養(yǎng)的標本應及時置于4℃冰箱存放以免影響細胞的活力，一般在采血后1～3 d內(nèi)可進行培養(yǎng)。在4℃冰箱保存6 d的標本我們也曾培養(yǎng)，且染色體質量也不錯。由于存放時間長，有活性的淋巴細胞少，此時應1000 r/min離心10 min后取白細胞層接種。

1.2 細胞培養(yǎng)基與接種全血量 人體血液中的淋巴細胞是一種分化細胞，它的細胞質很少，RNA和蛋白質的6合成速度也很慢，淋巴細胞幾乎都是處在G0期或G1期，一般情況下是不分裂的。當在培養(yǎng)基中加入植物血凝素(phytohemagglutinin PHA)時，這種小淋巴細胞受到刺激后轉化為淋巴母細胞，并開始進行有絲分裂，進入淋巴細胞生長周期。細胞經(jīng)過68～76 h的培養(yǎng)，處于分裂期的細胞可達20%以上(我們曾做過此類的實驗)，此時加入秋水仙素便可獲得大量的中期分裂相細胞。培養(yǎng)基為培養(yǎng)的細胞提供營養(yǎng)，培養(yǎng)基成份中小牛血清和植物血凝素的含量，PH值情況，均可影響染色體分裂指數(shù)。我們使用杭州四季青胎牛血清15%，HYCLONE1640液體培養(yǎng)基85%，廣州市醫(yī)藥工業(yè)研究所PHA 150 ug/ml，嚴格按無菌操作配制培養(yǎng)基。

接種前，將5 ml的培養(yǎng)液置室溫融化。將超凈工作臺用紫外燈消毒30 min后，在超凈臺內(nèi)用加樣槍吸取410ul左右的外周血接種到每瓶培養(yǎng)基內(nèi)、搖勻，淋巴細胞的接種密度應控制是在400～600個/ml。接種兩瓶。置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)68～76 h;如果接種時發(fā)現(xiàn)外周血有小凝塊，則搗碎凝塊，加大接種血量如600ul，亦可獲得成功。新生兒的標本由于血漿中含有較高的膽紅素［1］及淋巴細胞含量高，應減少接種量如300ul，或者1000r/min離心10 min后取白細胞層150ul接種。

1.3 秋水仙素 秋水仙素在細胞培養(yǎng)分裂中所起作用是與微管形成或解聚密切相關的。秋水仙素一方面能阻滯微管(紡錘絲)形成，或使已形成的微管解聚;另一方面，秋水仙素的作用又能促使DNA的復制和有關蛋白質合成［2］?？梢娗锼伤乜梢种莆⒐艿暮铣墒辜毎幱诜至阎衅冢钟猩锒拘?，影響細胞生長。因此，在血細胞培養(yǎng)時，秋水仙素加入的劑量及處理時間與中期分裂相的多少和染色體長短有密切的關系。在秋水仙素濃度對染色體有絲分裂阻斷率的影響方面，陳德清教授等進行了大量的工作［3］。若秋水仙素濃度大，則處理時間短，如濃度小，則處理時間長。但若秋水仙素加入過量，或處理時間過長，染色體凝集和收縮變小，或發(fā)生異常分裂現(xiàn)象，甚至染色體破碎，不宜用于觀察染色體的形態(tài)及計數(shù);若秋水仙素加人太少，或處理時間偏短，染色體形態(tài)偏長或無中期分裂相，也不易進行染色體觀察。故秋水仙素濃度及處理時間要準確把握。一般在血細胞培養(yǎng)68 h(即收獲細胞前2 h)，用微量加樣槍在各培養(yǎng)瓶內(nèi)加入30～40 uL秋水仙素，使最終濃度為0.04～0.08 ug/ml，置37℃溫箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h后收集細胞、制片，就能夠收集到分裂相非常好的染色體。但有時因時間關系，我們在血細胞培養(yǎng)68至76 h內(nèi)的各個時間點內(nèi)，在各培養(yǎng)瓶內(nèi)加入濃度30～40uL秋水仙素，使最終濃度為0.04～0.08 ug/ml，置37℃溫箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h后收集細胞、制片，亦能夠收集到分裂相非常好的染色體。甚至在終止培養(yǎng)前30 min加人150 uL秋水仙素使細胞生長停止在中期，也能收集到足夠數(shù)量及分裂相好的染色體核型。

1.4 制片

1.4.1 收集細胞 從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，用小吸管將培養(yǎng)物吹打均勻，移入10 ml刻度玻璃離心管內(nèi)，以1000 r/min離心10 min，吸去上清液，保留底物。在吸去上清液時，要避免與上清液接觸處的淋巴細胞層被吸棄，造成人為的大量中期分裂相細胞丟失。一般要求每次吸取上清液時都要在玻璃管的底部留上大約0.5 ml的上清液，以確保培養(yǎng)細胞不丟失。

1.4.2 低滲 低滲是制片好壞的關鍵環(huán)節(jié)。實驗室一般多用37℃預溫的0.075 mol/L的kcl低滲液，利用細胞內(nèi)K+濃度遠比細胞外K+濃度高這一特點，使淋巴細胞吸水膨脹和中期染色體分散鋪展，而非紅細胞解體，國內(nèi)許多學者認為低滲使紅細胞解體。為了達到淋巴細胞吸水膨脹但不自行破裂這一平衡點，低滲時間和低滲溫度一定要掌握好。低滲時間不充分，染色體分散不好，呈團狀;低滲過長，可引起細胞在滴片前破碎，染色體丟失，甚至由于染色體脹的太大而使之出現(xiàn)微毛和形態(tài)結構模糊不清，變得難以染色;低滲溫度不夠或預溫溫度不夠可出現(xiàn)胞漿背景等現(xiàn)象，造成制片時分裂相不分散。所以，低滲處理適當，所得染色體輪廓清楚，可染色性強，在顯帶染色時能很好地顯示帶型特征。我們一般加入提前37℃預溫的0.075 mol/L的kcl低滲液至8 ml刻度處，再用吸管快速吹打均勻，然后再置于37℃的水浴箱中，溫育25 min，便可得到理想的效果。

1.4.3 固定 在染色體制片過程中需加入甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定液，主要目的是維持染色體的固有形態(tài)及細胞膜;抽提白細胞內(nèi)的細胞質成份，從而有利于染色體分散;破壞紅細胞。固定液可使細胞脫水，蛋白變性而使染色體變的粗大而適中。固定液需現(xiàn)配現(xiàn)用。低滲后的預固定很重要，固定液量不要多，一般是加入新配固定液1.5 ml進行預固定，加入固定液后用吸管輕輕吹打均勻，以后的每個步驟都要輕柔。在室溫下靜置5 min，然后離心1000 r/min、10 min，吸去上清液(同樣注意不要將淋巴細胞層吸棄)，保留沉淀進行第一次固定;第一次固定時固定液沿管壁緩慢加入現(xiàn)配固定液，至管子8 ml刻度處，吹打均勻，離心1000 r/min、10 min，吸去上清液(同樣注意不要將淋巴細胞層吸棄)，保留沉淀進行第二次固定;第二次固定類同第一次固定。調(diào)配最后滴片的懸液時，冰醋酸的含量可適當增加，這有助于染色體的散開，但冰醋酸的量不能太多，一般為甲醇∶冰醋酸(2∶1)。

1.4.4 滴片 滴片也是染色體制片好壞很關鍵的一步。載玻片的清潔度;滴片時操作不當致所滴懸液重疊;懸液濃度過濃或過稀;滴片時的高度等都直接影響染色體的分散。滴片時，先將新配制的固定液加入離心管，制成細胞懸液，加入量因制片多少及細胞的多少而定，以我們的經(jīng)驗以呈薄霧狀為宜。滴片時需要有一定的高度，以使染色體分散良好。一般是用吸管吸取懸液后在30～40 cm左右處滴片，每張玻片上滴2～3滴，并用口輕輕吹散，馬上放入80℃的烤箱中，以助染色體分散、固定在玻璃片上。滴片數(shù)為4張內(nèi)。一張用于顯帶時預實驗，二張用于發(fā)報告，另外一張備用，如需要便可用于C帶，N帶等實驗，節(jié)約時間。

1.4.5 G顯帶技術 烤片時間應根據(jù)當前的空氣濕度，靈活把握時間，濕度大烤片時間可延長;濕度小烤片時間可縮短，我們實驗室一般烤片時間為80℃，3 h。準備立式染色缸3個：一缸為含0.025%胰酶的磷酸鹽緩沖液(pH7.4);另兩缸為生理鹽水。顯帶時，玻片放入37℃恒溫箱中預溫過的0.025%胰酶溶液中處理30 s左右(具體時間應做預實驗)，并不斷搖動玻片，使標本均勻接觸液體。然后取出迅速投入生理鹽水缸中漂洗，每次3s。漂洗后的玻片用配制好的Giemsa染液染色，時間為5 min(具體時間應做預實驗)，用流水沖掉染液、晾干，必要時封片、鏡檢。鏡檢時，先在低倍鏡下選擇分散好、長度適中的分裂相，然后轉換油鏡觀察其顯帶情況。這里需要提醒的是胰酶預溫時要注意預溫溫度，溫度過高可使胰酶變性失效，溫度過低胰酶活性不強，胰酶最適溫度為37℃;相同濃度，來源于豬、羊、牛的胰蛋白酶在G顯帶中的作用不盡相同，其中牛胰蛋白酶具有使染色體拉長的作用［4］;染色體在胰酶中的處理時間可因制片質量、片齡、烤片時間長短而不同;在不同個體的染色體制片中也可有差異;在進行預實驗時，應片頭，片中，片尾處盡可能多觀察染色體的顯帶情況，以便摸索出最佳的胰酶處理時間。最佳的顯帶結果是三分一的分裂相顯帶略過，三分一的分裂相顯帶剛好，三分一的分裂相顯帶略欠。

2 染色體G顯帶失敗標本的補救

G顯帶常常由于各種因素導致顯帶不夠，不能進行準確的核型分析，可以用無水乙醇或甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定液對由于胰蛋白酶消化時間短而致的失敗標本進行重新處理，收到了理想的效果。

2.1 無水乙醇脫色法 將未經(jīng)油鏡觀察后無香柏油的標本片放人無水乙醇中漂洗1～2 min，放在80℃烤箱烘烤10 min，取出后放人0.025%胰酶溶液中消化1 min，染色時間不變［5］。

2.2 甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定液脫色法 將經(jīng)油鏡觀察后有香柏油的玻片放入甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定液中浸泡1 h，取出后放80℃烤箱烘烤10 min，然后進行消化、染色。消化染色時間同無水乙醇脫色法［5］。

3 討論

染色體結構或數(shù)目異常所致疾病為染色體病?，F(xiàn)巳發(fā)現(xiàn)人類染色體數(shù)目和結構畸變3000余種，染色體病綜合征100余個［6］。每一位染色體病患者都會對家庭、社會造成沉重的精神和經(jīng)濟負擔，許多家庭由此因病致貧，因病返貧。檢出平衡易位攜帶者、發(fā)現(xiàn)染色體異常是我們每位細胞遺傳工作者的責任。同時加強產(chǎn)前診斷，防止染色體病患兒的出生，對提高人口素質有重大意義。

［1］李潔，徐文瑜，楊嬌英.外周血淋巴細胞培養(yǎng)及染色體G帶標本制備的實驗對策.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2006，14(1)：51-51．

［2］康曉慧.細胞生物學.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：240-241．

［3］白玉書.白玉書專輯.北京：中國人事出版社，2000：240．

［4］高麗君，宋芳，周立社，等．不同來源胰蛋白酶對染色體G顯帶的影響. 包頭：醫(yī)學院學報，2006，22(1)：77-78．

［5］張穎珍．人體外周血染色體G顯帶制備時的影響因素及補救措施. 中國優(yōu)生優(yōu)育，2010，16(5)：265-267．

［6］臨床常見染色體病診斷手冊.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：11．