尚小紅 ，陸定迎 ，周生茂 ，文俊麗 ，康紅衛(wèi)

（1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，南寧，530007；2.廣西南寧市興寧區(qū)昆侖鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心）

黃瓜（Cucumissativus L.）是全球性蔬菜作物之一，種植十分普遍。我國(guó)自20世紀(jì)50年代就開(kāi)始進(jìn)行黃瓜種質(zhì)資源的收集和利用研究[1]，但是目前黃瓜育種普遍存在育種材料遺傳基礎(chǔ)過(guò)于狹窄、親緣關(guān)系混亂等問(wèn)題，造成育種工作難以取得突破[2]。20世紀(jì)90年代，隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記作為黃瓜育種的輔助手段也逐步開(kāi)展。分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，尤其是建立在PCR基礎(chǔ)上的分子標(biāo)記技術(shù)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，使這些技術(shù)越來(lái)越易于為育種者所掌握。育種者可借助目標(biāo)基因緊密連鎖的遺傳標(biāo)記，鑒定分離群體中含有目標(biāo)基因的個(gè)體，以提高選擇的效率，即采用標(biāo)記輔助選擇（marker assisted selection，MAS）手段，減少傳統(tǒng)育種中形態(tài)標(biāo)記易受環(huán)境影響、周期較長(zhǎng)及盲目育種等缺陷，從而加速目標(biāo)育種進(jìn)程。本文綜述了分子標(biāo)記在國(guó)內(nèi)黃瓜遺傳育種中的應(yīng)用研究。

1 分子遺傳圖譜的構(gòu)建

分子遺傳圖譜的構(gòu)建是基因組研究中的重要環(huán)節(jié)，它是某一物種的染色體圖譜，顯示遺傳標(biāo)記的相對(duì)位置，而不是在每條染色體上特殊的物理位置。分子遺傳圖譜是比較基因組、基因定位與克隆以及基因組結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)與有力工具，通過(guò)分析遺傳圖譜能最終指導(dǎo)育種工作。

國(guó)內(nèi)黃瓜的分子連鎖圖譜的起步較晚，2004年，張海英等[3]以歐洲8號(hào)和秋棚雜交所得的重組自交系為材料，利用AFLP、SSR、RAPD技術(shù)，構(gòu)建了包含9個(gè)連鎖組群的圖譜，包括141個(gè)AFLP標(biāo)記、4個(gè)SSR標(biāo)記和89個(gè)RAPD標(biāo)記，覆蓋基因組長(zhǎng)度727.5 cM，平均圖距3.1 cM，這是我國(guó)學(xué)者獨(dú)立構(gòu)建的含有我國(guó)黃瓜遺傳背景的第一張分子遺傳連鎖圖譜。隨著分子標(biāo)記技術(shù)在國(guó)內(nèi)的發(fā)展，黃瓜的遺傳圖譜迅猛發(fā)展，迄今國(guó)內(nèi)研究者已構(gòu)建了10 多張黃瓜遺傳圖譜[4～11]。 2009 年，沈鏑[12]構(gòu)建了第一張以西雙版納黃瓜為構(gòu)圖親本，基于黃瓜全基因組測(cè)序開(kāi)發(fā)的SSR引物為標(biāo)記的黃瓜分子連鎖圖譜。該圖譜覆蓋黃瓜全基因組的7條染色體，圖譜總長(zhǎng)709.9 cM，相鄰標(biāo)記平均圖距為9.59 cM。沈麗平[13]構(gòu)建了含65個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)的遺傳連鎖圖譜，整個(gè)圖譜覆蓋7個(gè)連鎖群，全長(zhǎng)831.6 cM。王軍輝[14]構(gòu)建了一張包含7個(gè)連鎖群的遺傳圖譜，該圖譜覆蓋基因組862.886 cM，平均圖距為4.79 cM。程周超等[15]構(gòu)建了一張包含234個(gè)SSR位點(diǎn)，7個(gè)連鎖群的黃瓜遺傳圖譜，該圖譜覆蓋基因組長(zhǎng)度829.7 cM，平均圖距3.5 cM。李坤等[16]構(gòu)建了7個(gè)連鎖群組成的分子標(biāo)記遺傳圖譜，圖譜總長(zhǎng)764 cM，標(biāo)記間平均長(zhǎng)度7.49 cM。

從以上研究可以看出，黃瓜遺傳圖譜的構(gòu)建群體多為F2代，這些群體后代性狀易分離，不易準(zhǔn)確地對(duì)數(shù)量性狀進(jìn)行定位，不能永久保存，無(wú)法將其繼續(xù)飽和。因此，利用不易分離的永久性群體來(lái)進(jìn)行黃瓜遺傳圖譜的構(gòu)建，必將成為未來(lái)研究的趨勢(shì)。此外，因研究人員、育種目的、試驗(yàn)材料和分子標(biāo)記方法等不同，導(dǎo)致所得黃瓜連鎖圖譜大小不一，差異較大，可比性差，飽和度較低，遺傳信息不能共享。因此綜合使用各種分子標(biāo)記技術(shù)，建立通用分子標(biāo)記，增加標(biāo)記位點(diǎn)和圖譜整合工作是增加圖譜飽和度的有效途徑，可為基因的定位、克隆和功能分析等奠定必要的基礎(chǔ)。

2 遺傳多樣性評(píng)價(jià)

種質(zhì)材料是遺傳育種研究的基礎(chǔ)，但有些種質(zhì)群體無(wú)法依靠田間表型進(jìn)行快速有效的區(qū)分，而分子標(biāo)記為此類(lèi)種質(zhì)資源的分類(lèi)、鑒定和評(píng)價(jià)提供了新方法并開(kāi)創(chuàng)了遺傳多樣性研究的新局面。1998年，張海英等[2]利用RAPD技術(shù)對(duì)多個(gè)生態(tài)型的34個(gè)黃瓜材料的遺傳親緣關(guān)系進(jìn)行了研究聚類(lèi)分析，將供試材料分為3大類(lèi)群：華北類(lèi)群、華南類(lèi)群和歐洲溫室類(lèi)群。這是國(guó)內(nèi)首次將分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于種質(zhì)資源分類(lèi)，2000年以后，國(guó)內(nèi)學(xué)者興起了相關(guān)研究的高潮。 顧興芳等[17]、劉殿林等[18]、陳勁楓等[19]、李錫香等[20]、李麗[21]、耿紅[1]、王佳等[22]，張桂華等[23]、司旻星[24]、穆生奇[25]和楊福強(qiáng)[26]分別采用 AFLP、RAPD、SSR 和 RAPD、AFLP、SRAP、AFLP、ISSR、AFLP、SSR以及SCAR、SSR、AFLP的分子標(biāo)記方法對(duì)黃瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行了分析。借鑒分子標(biāo)記研究的不同黃瓜之間的親緣關(guān)系得出，各個(gè)材料在分類(lèi)和起源上說(shuō)法不一，多數(shù)研究認(rèn)為，大部分華北型種質(zhì)同源性極高、遺傳變異度較小、多樣性水平較低，可歸為同一類(lèi)；西雙版納黃瓜單獨(dú)歸為一類(lèi)；歐洲溫室型、華南型黃瓜種質(zhì)的分類(lèi)上存在分歧。但分子標(biāo)記分類(lèi)結(jié)果與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)表型分類(lèi)結(jié)果一致，說(shuō)明分子標(biāo)記技術(shù)能有效地應(yīng)用于種質(zhì)資源的遺傳多樣性評(píng)價(jià)。2009年，沈鏑[12]單獨(dú)對(duì)西雙版納黃瓜種質(zhì)進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果顯示，不同來(lái)源地的西雙版納黃瓜在遺傳組成上存在差異，大多數(shù)種質(zhì)的分組與瓜皮色和瓜肉色基本一致，按不同來(lái)源可將種質(zhì)分為5個(gè)群體，其中景洪群體的遺傳多樣性最高。

3 種子純度鑒定

在黃瓜育種中，雜交種子純度鑒定非常重要。傳統(tǒng)鑒定方法費(fèi)時(shí)耗地，積壓資金，影響銷(xiāo)售。利用分子標(biāo)記鑒定簡(jiǎn)便快速，極大地加快了種子純度檢驗(yàn)的速度和效率，對(duì)于新品種的保護(hù)及維護(hù)育種者的權(quán)益具有重大意義。

李麗等[21]得到了2對(duì)SRAP引物，可以分別區(qū)分黃瓜寶雜2號(hào)和碧玉2個(gè)雜交種的F1代與親本，并且個(gè)體種苗之間在鑒別帶位置穩(wěn)定重復(fù)，可以用于雜交種的雜交純度檢測(cè)。盧銳等[27]以黃瓜雜交品種哈研808及其親本為試驗(yàn)材料，利用102對(duì)EST-SSR引物對(duì)其進(jìn)行純度分析篩選合適的引物。結(jié)果表明，76號(hào)和81號(hào)這2對(duì)EST-SSR引物能夠用于黃瓜雜交種子純度的鑒定。張桂華等[28]以黃瓜新品種津優(yōu)35號(hào)為材料，利用80多對(duì)SSR引物篩選特異分子標(biāo)記。結(jié)果表明，85號(hào)和212號(hào)引物在雜交種和親本間表現(xiàn)多態(tài)性，雜交種條帶為父母本的互補(bǔ)型，且特異性強(qiáng)，適合做雜交種純度鑒定，且引物鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果吻合率高達(dá)96%以上，表明所篩選到的2個(gè)SSR標(biāo)記可以作為津優(yōu)35號(hào)的特異分子標(biāo)記用于其種子純度的鑒定。

目前國(guó)內(nèi)黃瓜種子純度鑒定研究主要采用SRAP和SSR標(biāo)記技術(shù)，形式比較單一，應(yīng)將傳統(tǒng)的田間形態(tài)學(xué)鑒定和多個(gè)分子標(biāo)記緊密結(jié)合，使分子標(biāo)記結(jié)果與種子田間表現(xiàn)型相一致，最終為黃瓜育種服務(wù)。

4 基因定位

對(duì)重要基因的準(zhǔn)確定位，可以為分子標(biāo)記輔助育種，整合圖譜和品種改良等工作提供有利幫助，同時(shí)使進(jìn)一步克隆目標(biāo)基因及基因的轉(zhuǎn)移成為可能。

潘俊松等[6]將黃瓜始花節(jié)位性狀控制基因定位在第9條連鎖群上，與兩側(cè)標(biāo)記的距離分別為10.3，2.1 cM。杜輝[8]對(duì)黃瓜果實(shí)光澤（D）與果刺大小（ss）性狀進(jìn)行了定位分析。結(jié)果表明，D與ss定位在固定標(biāo)記連鎖圖的第6連鎖群上，D與SSR標(biāo)記CMCTN71的距離為25.8 cM，ss和D間距11.7 cM。李楠[10]將黃瓜對(duì) ZYMV-CH、PRSV-W、WMV 三種病毒的抗性基因定位在整合遺傳圖譜的G3連鎖群上，并且簇聚在15 cM的區(qū)間。他首次將黃瓜對(duì)ZYMV-CH、PRSV-W、WMV三種病毒的抗性基因同時(shí)在遺傳圖譜上定位，在分子水平上確認(rèn)了3種病毒的簇聚性。并且將黃瓜對(duì)枯萎病的抗性基因pm定位在整合遺傳圖譜的G1連鎖群上，白粉病的抗性基因Fw定位在整合遺傳圖譜的G10連鎖群上，獲得了緊密連鎖分子標(biāo)記。李曼等[29]將Bi基因定位在黃瓜的第6染色體上。

5 數(shù)量性狀的QTL分析

王剛等[5]檢測(cè)到4個(gè)控制黃瓜側(cè)枝數(shù)和側(cè)枝平均長(zhǎng)度的QTL，其中，對(duì)側(cè)枝數(shù)和側(cè)枝長(zhǎng)度貢獻(xiàn)率最大的QTL位點(diǎn)均位于第2連鎖群；張海英等[30]定位了5個(gè)葉面積增長(zhǎng)量的QTL位點(diǎn)；楊迪菲[31]檢測(cè)到3個(gè)黃瓜耐熱性的QTL位點(diǎn)；劉龍洲[7]檢測(cè)到9個(gè)白粉病抗性QTLs；辛明等[32]檢測(cè)到株高的2個(gè)QTL位點(diǎn)；徐晴[9]共找到8個(gè)控制雌花節(jié)位的QTL位點(diǎn)；沈麗平[13]檢測(cè)到控制黃瓜白粉病抗性的2個(gè)QTL位點(diǎn)都位于第3連鎖群上；嵇怡等[11]檢測(cè)到控制黃瓜株高性狀的2個(gè)QTL位點(diǎn)和控制節(jié)間距的1個(gè)QTL位點(diǎn)均位于第4連鎖群上；控制第一雌花開(kāi)花期的QTL 位點(diǎn) 7 個(gè)， 分別位于第 1，2，3，5，7 連鎖群上；沈鏑[12]在第4～7染色體上分別檢測(cè)到與果肉色有關(guān)的QTL位點(diǎn)5個(gè)。其中在第4染色體上檢測(cè)到2個(gè)與胡蘿卜素含量有關(guān)的主效QTL。另外，在第3～6染色體上檢測(cè)到7個(gè)QTL位點(diǎn)，分別與第1雌花節(jié)位、單瓜種子數(shù)和成株白粉病抗性有關(guān)；張鵬[33]檢測(cè)到1個(gè)與黃瓜果實(shí)彎曲性相關(guān)的QTL位點(diǎn)；程周超等[15]檢測(cè)到5個(gè)與黃瓜瓜長(zhǎng)相關(guān)的QTL位點(diǎn)，分布在第1，4，6號(hào)染色體上；孫洪濤等[34]檢測(cè)到1個(gè)與黃瓜果實(shí)橫徑相關(guān)的QTL，位于CSWCT25-CSWCT29-CSWTA03連鎖群上；苗晗等[35]檢測(cè)到8個(gè)控制復(fù)雌花性狀的 QTL 位點(diǎn)，分布在第 1，2，3，6，7 染色體上；王軍輝[14]檢測(cè)到17個(gè)控制CMV抗性的QTL位點(diǎn)；李坤等[16]在2009年和2010年分別獲得4個(gè)和5個(gè)與黃瓜種子含油量性狀相關(guān)的QTL位點(diǎn)，聯(lián)合貢獻(xiàn)率分別為32.7%和35.4%；張冠英等[36]檢測(cè)到15個(gè)控制下胚軸性狀的 QTLs，分別定位在 LG1、LG2、LG4、LG6和LG7連鎖群上。

黃瓜的大多數(shù)農(nóng)藝性狀是由多基因或QTL控制的數(shù)量性狀，采用田間調(diào)查統(tǒng)計(jì)形態(tài)學(xué)性狀的方法，有時(shí)性狀不易區(qū)分，費(fèi)時(shí)耗力，有很大的難度，分子標(biāo)記為此提供了有力工具，將分子標(biāo)記輔助選擇與傳統(tǒng)的育種融合起來(lái)，取長(zhǎng)補(bǔ)短，將大大提高目標(biāo)性狀的選擇性，更好地為黃瓜育種服務(wù)。

6 相關(guān)分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)

利用分子標(biāo)記不僅可以定位目標(biāo)基因，還可追蹤目標(biāo)基因，進(jìn)而進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。利用分子標(biāo)記對(duì)單基因控制的性狀進(jìn)行輔助選擇將在黃瓜遺傳育種中廣泛應(yīng)用。

6.1 抗病分子標(biāo)記

分子標(biāo)記技術(shù)在黃瓜抗病育種中也得到了廣泛應(yīng)用，先后獲得了與黑星病抗性基因連鎖的1個(gè)AFLP和3個(gè)SSR[37～39]標(biāo)記；與白粉病抗性基因連鎖的2 個(gè) AFLP、4 個(gè) SSR 和 1 個(gè) ISSR 標(biāo)記[410～43，13]；與霜霉病抗性基因連鎖的1個(gè)RAPD和1個(gè)AFLP標(biāo)記[44，45]；與抗黃瓜枯萎病基因連鎖的1個(gè)RAPD標(biāo)記和1個(gè)AFLP標(biāo)記[46，47]；與抗黃瓜炭疽病基因連鎖的1個(gè)AFLP標(biāo)記，并將其成功的轉(zhuǎn)化為簡(jiǎn)單實(shí)用的SCAR標(biāo)記[48，49]；與黃瓜抗小西葫蘆黃花花葉病毒ZYMVCH基因的2個(gè)AFLP標(biāo)記[50]以及2個(gè)與黃瓜花葉病毒CMV抗性相關(guān)的AFLP標(biāo)記[51，52]。

由以上研究可以看出，分子標(biāo)記在黃瓜黑星病、白粉病、霜霉病、枯萎病、炭疽病、ZYMV-CH及黃瓜花葉病毒研究中得到了應(yīng)用，這些研究為黃瓜抗病育種奠定了基礎(chǔ)。

6.2 性型分化與單性結(jié)實(shí)的分子標(biāo)記

黃瓜屬于葫蘆科植物，分為7種不同的性型，雌全同株、雄全同株、雌雄全同株、兩性花株、雌雄異花同株、全雌株和全雄株。作為植物性型研究的模式作物，黃瓜性型分化基因分子標(biāo)記的篩選和定位，對(duì)植物性型表達(dá)的分子和生理機(jī)制研究以及甜瓜屬的育種都有重要的意義。

陳勁楓等[53]應(yīng)用RAPD-BSA方法獲得了與黃瓜全雌性特異相關(guān)的片段B11-1000，該標(biāo)記的獲得為黃瓜性別特異基因的分離和克隆奠定了基礎(chǔ)。婁群峰[54]獲得一個(gè)與全雌性位點(diǎn)連鎖距離為12.2 cM的標(biāo)記。鄧思立等[55]找到一個(gè)與M基因間距為17.8 cM的SRAP標(biāo)記ME23SA4。畢喜紅[56]得到一個(gè)與黃瓜全雌性相關(guān)的SRAP標(biāo)記，并將其轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。周曉燕[57]得到與黃瓜全雌性相關(guān)的RAPD標(biāo)記，并將其成功的轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。時(shí)秋香等[58]獲得了3個(gè)與M基因緊密連鎖的標(biāo)記SSR23487、SCAR123和SSR19914，它們與M基因的遺傳距離分別為0.28，0.94，3.20 cM，兩側(cè)標(biāo)記 SSR23487 和 SCAR123將M基因定位在1.22 cM的遺傳區(qū)間內(nèi)。這些分子標(biāo)記的獲得不僅可以用于分子標(biāo)記輔助選擇育種,而且為最終M基因的克隆打下了基礎(chǔ)。陳學(xué)好等[59]找到了一個(gè)與單性結(jié)實(shí)基因連鎖距離為18.9 cM的ISSR標(biāo)記，為黃瓜單性結(jié)實(shí)基因的分子標(biāo)記篩選和分子標(biāo)記輔助育種奠定了初步基礎(chǔ)。

6.3 品質(zhì)及農(nóng)藝性狀的分子標(biāo)記

顧興芳等[60]找到了與苦味基因連鎖的2個(gè)顯性AFLP標(biāo)記：E23M662 101和E25M652 213。池秀蓉等[61]獲得了1個(gè)與營(yíng)養(yǎng)器官無(wú)苦味位點(diǎn)連鎖距離為6.43 cM的AFLP分子標(biāo)記TG/GCT150，并成功地將其轉(zhuǎn)化為操作簡(jiǎn)便、表現(xiàn)穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記SC87。李曼等[29]將Bt基因定位在黃瓜的第6染色體上，最近的兩側(cè)翼標(biāo)記SSR02309和SSR00004與苦味基因分別相距1.7和2.2 cM。張圣平等[62]構(gòu)建了Bt基因的SSR連鎖群，該連鎖群包含8個(gè)SSR標(biāo)記，與Bt基因最近的兩側(cè)標(biāo)記為SSR10795和SSR07081，遺傳距離分別為0.8 cM和2.5 cM。經(jīng)驗(yàn)證明，兩標(biāo)記檢測(cè)的正確率均為91.6%。通過(guò)與前人發(fā)表的高密度圖譜比較，將Bt基因定位在黃瓜第5染色體短臂一端3.3 cM范圍內(nèi)。王桂玲等[63]篩選獲得了5對(duì)與黃瓜果瘤相關(guān)的SSR標(biāo)記。嵇怡等[64]應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)和BSA法尋找與黃瓜矮生基因連鎖的分子標(biāo)記。結(jié)果表明，UBC818的擴(kuò)增片段與黃瓜矮生基因間的遺傳距離為11.1 cM。

6.4 抗逆性相關(guān)的分子標(biāo)記

楊迪菲[31]檢測(cè)到4個(gè)SSR和7個(gè)RAPD位點(diǎn)與黃瓜耐熱性相關(guān)。陳飛雪等[65]檢測(cè)到1個(gè)SSR標(biāo)記和9個(gè)SRAP標(biāo)記與黃瓜耐高溫QTL連鎖，對(duì)表型的貢獻(xiàn)率為6%～17%。

由以上開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記可以看出，分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)已滲透到黃瓜遺傳育種研究的各個(gè)方面，有力地推動(dòng)了黃瓜育種的進(jìn)程。新的分子標(biāo)記不斷出現(xiàn)和完善，必將為分子育種發(fā)揮更大的作用。

7 展望

從分子遺傳圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性評(píng)價(jià)、種子純度鑒定、基因定位、數(shù)量性狀的QTL分析、相關(guān)分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)（包括抗病、性型分化及單性結(jié)實(shí)、品質(zhì)及農(nóng)藝性狀和抗逆）這幾個(gè)方面來(lái)闡述分子標(biāo)記技術(shù)在黃瓜遺傳育種中的應(yīng)用。雖然分子標(biāo)記在黃瓜育種中取得了很大發(fā)展，但分子標(biāo)記作為輔助選擇手段育成新品系或品種尚處于探索階段。非永久性作圖群體所構(gòu)建的遺傳圖譜很難再進(jìn)行飽和，難以準(zhǔn)確地對(duì)其進(jìn)行重要農(nóng)藝性狀的QTL定位，同時(shí)由于使用的研究材料不同，無(wú)法在各個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行比較研究和合作試驗(yàn)，同時(shí)穩(wěn)定性和重復(fù)性很差，因此今后應(yīng)嘗試?yán)糜谰眯匀后w如NILs、RILs和DH群體來(lái)構(gòu)建遺傳圖譜。并在此基礎(chǔ)上加強(qiáng)已開(kāi)發(fā)的標(biāo)記的整合，提高其通用性。此外，分子標(biāo)記技術(shù)在黃瓜抗病育種方面的研究較多，今后也應(yīng)加強(qiáng)其在抗逆境及品質(zhì)育種方面的應(yīng)用，逐漸建立起高通量和高效的黃瓜多基因聚合分子育種技術(shù)，為培育更多符合市場(chǎng)需求，兼具早熟性、高品質(zhì)、抗病、抗逆和豐產(chǎn)的新品種提供技術(shù)支持。

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