段 芳,蘭志剛,李衛(wèi)娟

(1.昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，云南 昆明 650214；2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南 昆明 650224)

隨著遺傳學(xué)理論的不斷發(fā)展，動物遺傳育種技術(shù)經(jīng)歷了表型和表型值選種技術(shù)育種、DNA重組技術(shù)育種、分子技術(shù)育種3個階段。其中，在20世紀80年代國際上動物育種已進入分子水平，朝著快速改變動物基因型的方向發(fā)展，即開始分子育種技術(shù)階段。國內(nèi)也緊跟國際步伐，主要研究畜禽遺傳育種的分子生物學(xué)基礎(chǔ), 為我國21世紀畜牧業(yè)的發(fā)展提供理論基礎(chǔ)和先進技術(shù)。現(xiàn)在，動物分子育種仍占據(jù)著動物育種大部分的領(lǐng)地，并將主導(dǎo)21世紀動物遺傳育種的發(fā)展趨勢。本文就動物遺傳育種的過程、理論基礎(chǔ)、國內(nèi)研究現(xiàn)狀以及發(fā)展趨勢進行綜述。

1 表型和表型值選種技術(shù)育種

這一階段是1900～1960年，即從孟德爾論文的重新發(fā)現(xiàn)到法康納的《數(shù)量遺傳學(xué)概論》第1版問世[1]。1856～1865年孟德爾在豌豆雜交試驗中發(fā)現(xiàn)了遺傳學(xué)的分離和自由組合定律，并在布隆博物學(xué)會刊發(fā)表了題為“植物雜交試驗”的論文，但這一重大發(fā)現(xiàn)實際上并未引起科學(xué)界的關(guān)注，直到1900年由荷蘭阿姆斯特丹大學(xué)教授狄·弗里斯、德國土賓根大學(xué)教授科倫斯和奧地利維也納農(nóng)業(yè)大學(xué)講師馮·切爾邁克幾乎同時發(fā)現(xiàn)并證實了孟德爾遺傳規(guī)律，從而引起了科學(xué)界的廣泛重視，也標(biāo)志著經(jīng)典遺傳學(xué)的開始。在1909年瑞典遺傳學(xué)家H.尼爾松-埃勒提出多基因假說，用每對微效基因的孟德爾式分離來解釋數(shù)量性狀的遺傳。1910年摩爾根和他的3位杰出學(xué)生用果蠅進行了大量實驗發(fā)現(xiàn)了經(jīng)典遺傳學(xué)的第3個基本規(guī)律——遺傳連鎖規(guī)律；1918年Fisher發(fā)表了“根據(jù)孟德爾遺傳假設(shè)的親屬間相關(guān)研究”，預(yù)示著數(shù)量遺傳學(xué)的誕生。數(shù)量遺傳學(xué)是孟德爾遺傳學(xué)的進一步發(fā)展，孟德爾遺傳學(xué)的許多原理都適用于它，不同之處在于孟德爾遺傳學(xué)中的性狀主要決定于主要基因，即它們是由能分別辨認其效果的一對、兩對或三對基因的分離、自由組合和連鎖所造成的，而數(shù)量遺傳學(xué)所研究的性狀則是由效果極其微小，因而不能分別辨認的多基因所造成的。1953年沃森和克里克發(fā)現(xiàn)的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)標(biāo)志著遺傳學(xué)從此邁進了分子遺傳學(xué)的新時代[2]。在多基因假說中提到的數(shù)量性狀表型值就是一個性狀能夠直接度量或觀察的數(shù)值，任何一個數(shù)量性狀的表現(xiàn)都是遺傳和環(huán)境共同作用的結(jié)果，即性狀的表型值可分為由遺傳和環(huán)境因素造成兩部分；而育種值選種既不包括不遺傳的環(huán)境效應(yīng), 也不包含可以遺傳但不易固定的顯性和上位效應(yīng), 它反映的是可以遺傳且能夠被固定的基因加性效應(yīng)部分。因此，隨著育種學(xué)的發(fā)展表型和表型值選種必須向動物育種的第二階段發(fā)展，即育種值育種。

2 計算機和DNA重組技術(shù)育種

動物育種的第2階段是1961～1986年，這個階段是分子遺傳學(xué)飛速發(fā)展的時期[1]。1961年Francois Jacob 和Sydney Brenner闡明了基因指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的分子過程；1966年Marshal l WN和Ha r GK破譯了全部的三聯(lián)體“遺傳密碼”，為現(xiàn)在的分子遺傳學(xué)奠定了基礎(chǔ)；1970年HTemin和DBal t imore發(fā)現(xiàn)了在一些RNA病毒中依賴RNA的DNA復(fù)制酶，即逆轉(zhuǎn)錄酶；1971年DNathans和HOSmith發(fā)現(xiàn)了能夠在特定位點切割DNA的限制性內(nèi)切核酸酶；1972年P(guān)aul Berg首次在體外試驗了DNA重組；1973年Herb Boyer和Stanley Cohen利用質(zhì)?？寺×送庠碊NA；1977年Wal ter Gilber t和Frederick Sanger發(fā)明了測定DNA序列的方法，1985年Kar ry Mul l is發(fā)明了聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)[2]。這一系列的發(fā)現(xiàn)和發(fā)明為DNA重組技術(shù)的出現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)。DNA重組技術(shù)改變了常規(guī)雜交的基因?qū)敕椒? 可以使所需要的目的基因被轉(zhuǎn)入而不帶有其它不需要的基因, 從而使快速育種成為可能。在DNA重組技術(shù)發(fā)展的同時，微型計算機技術(shù)也在快速發(fā)展，計算機的應(yīng)用使動物主要經(jīng)濟性狀的育種從表型值選擇進入育種值選擇, 大大提高了選種的準確性。

3 分子技術(shù)育種

分子育種是動物育種的第3個階段，是依據(jù)分子遺傳學(xué)和分子數(shù)量遺傳學(xué)的理論，利用DNA重組改良畜禽品種的一種技術(shù)。動物分子育種分為轉(zhuǎn)基因育種和基因組育種。轉(zhuǎn)基因育種是通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將外源性基因?qū)氲絼游锘蚪M上，從而達到改良重要生產(chǎn)性狀(如生長率、遺傳抗性等)或非常規(guī)性育種性狀(如生產(chǎn)人類藥用蛋白、工業(yè)用酶等)的目標(biāo)?；蚪M育種是通過DNA標(biāo)記技術(shù)來對某些重要生產(chǎn)性狀基因座位直接進行選擇改良, 也可以同時考慮到多個生產(chǎn)性狀座位, 甚至是動物個體的整個基因組，因此也可稱為基因組掃描選擇。

3.1 轉(zhuǎn)基因育種

動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將外源基因整合到動物受體體細胞基因組上，并在受體動物體內(nèi)穩(wěn)定表達出相應(yīng)的生物學(xué)表型的一種技術(shù)，其包括轉(zhuǎn)基因重組子構(gòu)建技術(shù)、重組子導(dǎo)入動物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化技術(shù)、轉(zhuǎn)基因在受體動物染色體上穩(wěn)定整合及可控性表達技術(shù)等。轉(zhuǎn)基因動物的產(chǎn)生標(biāo)志著人們可成功應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，避開物種間雜交不育的生殖隔離，進行基因交流，打破物種界限，突破親緣關(guān)系的限制，培育出自然界和常規(guī)育種難以產(chǎn)生的具特別優(yōu)良性狀的動物品種；可以改變常規(guī)育種需要進行多代雜交，所需時間長的缺點，從而加快育種進程。

轉(zhuǎn)基因動物育種可以充分利用所有可能的遺傳變異，從而極大地提高畜禽遺傳改良的幅度和速度，同時還可根據(jù)人們的需求創(chuàng)造出一些非常規(guī)的畜牧產(chǎn)品。因此，轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)在20世紀80年代初誕生時起，它就在改良畜禽生產(chǎn)性狀、提高畜禽抗病力以及利用轉(zhuǎn)基因畜禽生產(chǎn)非常規(guī)畜牧產(chǎn)品等方面展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景[3]。

3.1.1 轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良動物重要生產(chǎn)性狀 豬作為優(yōu)質(zhì)的肉用型家畜，人們對其瘦肉率、肉質(zhì)等主要經(jīng)濟性狀方面的育種改良一直在做不懈的努力。1985年Hammer和Bem首次用顯微注射技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因豬，其生長速度顯著高于同窩非轉(zhuǎn)基因豬，胴體脂肪明顯減少，且飼料利用率提高17%[4]。1999年4月加拿大安大略省的硅湖大學(xué)基因工程研究人員利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出了環(huán)保豬，是世界上第1只能解決環(huán)境保護問題的動物，其排出的糞便含磷量減少75%[5]。2006年4月美國密蘇里-哥倫比亞大學(xué)的賴良學(xué)等獲得了轉(zhuǎn)線蟲fat-1基因(ω-3去飽和酶基因)的體細胞克隆豬[6],其體內(nèi)表達的外源基因可以將豬體內(nèi)的ω-6系飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為ω-3系不飽和脂肪酸,提高了ω-3系脂肪酸含量,降低ω-6/ω-3的比例，顯著提高了豬肉的營養(yǎng)價值。湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所與中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所合作，將抗豬瘟病毒(HCV)的核酶基因?qū)胴i中，獲得抗豬瘟病毒的轉(zhuǎn)基因豬，從而提高抗病能力[5]。

牛是奶肉均提供的優(yōu)良家畜，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對牛進行品種改良或新品種培育主要體現(xiàn)在提高牛的抗病能力和提高牛的肉奶產(chǎn)量、改善肉奶品質(zhì)。Donovan等[7]在2005年將編碼溶葡球菌酶的基因轉(zhuǎn)入奶?；蚪M中獲得轉(zhuǎn)基因牛。結(jié)果表明，其乳腺中表達的溶葡球菌酶可以有效預(yù)防由葡萄球菌引起的乳腺炎，轉(zhuǎn)基因牛葡萄球菌感染率僅為14%，而非轉(zhuǎn)基因牛感染率達71%；2003年，Brophy等[8]研究人員在奶牛的胚胎細胞中加入β酪蛋白和κ酪蛋白，成功培育的轉(zhuǎn)基因奶牛所產(chǎn)的奶中β酪蛋白含量提高了20%，κ酪蛋白的含量也增加了一倍。

羊是一種以產(chǎn)肉為主、產(chǎn)奶為輔的家畜，其肉和奶的營養(yǎng)價值均高于牛。國內(nèi)外利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育的綿、山羊新品種重在提高羊毛產(chǎn)量和質(zhì)量、改善奶品質(zhì)、提高抗病力等不同性狀。1998年，Bawden等[9]將毛角蛋白II型中間細絲基因?qū)刖d羊基因組并使其在皮質(zhì)中特異表達，結(jié)果轉(zhuǎn)基因羊毛光澤亮麗，羊毛中羊毛脂的含量明顯提高。2005年，澳大利亞科學(xué)家Amdas等[10]通過對成年轉(zhuǎn)綿羊生長激素基因的綿羊做性能測定發(fā)現(xiàn)，其生長速度和羊毛產(chǎn)量都比對照組有顯著提高；2006年，美國科學(xué)家Maga等[11]培育出在乳腺中特異表達人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因山羊，蛋白表達量達270mg/L，用奶樣對豬仔的飼喂試驗表明，含重組人溶菌酶的奶樣能顯著減少豬仔胃腸道的大腸桿菌等細菌數(shù)，并能有效抑制奶樣嗜冷腐敗菌和引起乳腺炎的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長，從而可用于培育抗乳腺炎的轉(zhuǎn)基因羊新品種。

3.1.2 非常規(guī)性轉(zhuǎn)基因育種 非常規(guī)性轉(zhuǎn)基因育種是將人類藥用蛋白基因或工業(yè)用酶基因?qū)胄笄莼蚪M，使畜禽生產(chǎn)非常規(guī)性畜牧產(chǎn)品的技術(shù)。其將畜禽變?yōu)楦咝a(chǎn)藥用蛋白或工業(yè)用酶的化工廠，因此可稱為動物生物反應(yīng)器。動物生物反應(yīng)器主要是研究動物乳腺反應(yīng)器和動物血液反應(yīng)器，其原理就是將與人體相關(guān)基因整合到動物胚胎里，使生出的轉(zhuǎn)基因動物血液中，或長大后產(chǎn)生的乳汁中含有人類所需要的不同蛋白質(zhì)。2000年12月中國農(nóng)業(yè)大學(xué)成功獲得了我國首例轉(zhuǎn)有人α1-抗胰蛋白酶基因的轉(zhuǎn)基因羊[5]。2003年，加拿大研究人員Lazaris等[12]研制出可產(chǎn)蛛絲蛋白的轉(zhuǎn)基因山羊，這種在羊奶中生產(chǎn)的重組蛛絲蛋白可以“織”成高強度絲線。這種人造蜘蛛絲有蠶絲的質(zhì)感、有光澤、彈性極強，因此被稱為“生物鋼”，在醫(yī)療、軍事和建材、航天、航海等方面將有廣闊的應(yīng)用前景。2006年4月，韓國人Park J K等[13]通過精子顯微注射豬受精卵獲得了整合人重組促紅細胞生成素的轉(zhuǎn)基因豬，對后代泌乳母豬的乳樣檢測得出其氨基酸組成與商業(yè)化的重組hEPO完全相同。2002～2006年，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)李寧教授及其科研團隊獲得了轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白克隆奶牛。牛乳中人乳鐵蛋白和人α-乳清白蛋白表達量分別達到3.43 g/L和1.55 g/L，人溶菌酶在轉(zhuǎn)基因牛乳中含量達1.5 g/L以上，這些重組蛋白的表達量達到了國際先進水平[5]。

3.2 基因組育種

基因組育種是分子育種在高通量測序時代的產(chǎn)物，即利用高通量測序技術(shù)對群體進行研究、定位到控制某個目標(biāo)性狀的基因，然后通過序列輔助篩選或者轉(zhuǎn)基因的方法來選育新的品種。

3.2.1 分子遺傳標(biāo)記 同一物種的兩個個體存在DNA序列差異的位點，這些位點用遺傳標(biāo)記就稱為分子遺傳標(biāo)記或DNA標(biāo)記。分子遺傳標(biāo)記是以分子遺傳學(xué)和分子數(shù)量遺傳學(xué)為理論，利用分子生物學(xué)技術(shù)來改良畜禽品種的一種方法。其中在動物育種上應(yīng)用較廣泛的分子遺傳標(biāo)記有限制性片段長度多態(tài)分析技術(shù)(RFLP)、線粒體DNA標(biāo)記(mtDNA)、隨機引物擴增多態(tài)性DNA技術(shù)(RAPD)、擴增片段長度多態(tài)性分析技術(shù)(AFLP)和單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(SNP標(biāo)記)等。

RFLP標(biāo)記RFLP標(biāo)記是指用限制性內(nèi)切酶切割不同個體基因組DNA后, 含同源序列的酶切片段在長度上的差異。限制性片段的長度的多態(tài)性應(yīng)通過DNA分子雜交來檢測。S.Hiendleder等利用RFLP技術(shù)對綿羊線粒體DNA(mtDNA)進行研究，并得出世界范圍內(nèi)的綿羊存在野生和突變兩種類型，并且存在于品種內(nèi)和品種間[14]。RFLP可作為共顯性的遺傳標(biāo)記，區(qū)分純合和雜合基因型，其主要用于構(gòu)建遺傳圖譜和目標(biāo)基因的標(biāo)記，但不足處是RFLP多態(tài)信息含量低、成本高、測定方法復(fù)雜。

m tDNA標(biāo)記線粒體DNA是高等動物唯一的核外遺傳物質(zhì),是一種約16.5 kb的雙鏈雙環(huán)狀分子,比DNA具有更高的進化速度。造成mtDNA多態(tài)性的原因主要是堿基取代、長度變化和序列重排,因而可以用限制性酶切技術(shù)直接檢測mtDNA的多態(tài)性。mtDNA在種間、種內(nèi)群體間和群體內(nèi)具有廣泛的多態(tài)性，在分子進化和系統(tǒng)發(fā)育中有許多獨特的優(yōu)越性，作為有用的遺傳標(biāo)記已廣泛應(yīng)用在畜禽的遺傳育種中。黃勇富等用24種限制性內(nèi)切酶分析了1個引入品種豬、2個野豬和21個地方品種豬的mtDNA，得出我國地方豬品種的遺傳多樣度僅為0.007%，表明中國地方豬種遺傳多樣性非常貧乏，揭示了中國地方豬種可能起源于一個野豬亞種[14]。

RAPD標(biāo)記RAPD標(biāo)記是用9～10個核苷酸的隨機序列作為引物，通過DNA聚合酶鏈式反應(yīng)擴增基因組。RAPD技術(shù)是在1990年由Wi l l iam和Welsh等人利用PCR技術(shù)發(fā)展的檢測DNA多態(tài)性的方法。RAPD標(biāo)記比RFLP具有簡便、快捷和多態(tài)性檢出率高等特點，其主要應(yīng)用于目標(biāo)基因標(biāo)記、遺傳資源鑒定及分類。RAPD的不足處是多數(shù)位點的帶型表現(xiàn)為顯隱性共存的特點，不能區(qū)分純、雜合子；RAPD擴增反應(yīng)靈敏易受外源及污染DNA干擾。朱飛云等用RAPD分析綿羊品種間的遺傳關(guān)系，得出中國美利奴A品系構(gòu)成的姊妹群依次與哈薩克羊、中國美利奴多胎品系成為對應(yīng)的姊妹品種[15]。

AFLP標(biāo)記AFLP標(biāo)記是將基因組DNA酶切后形成分子量大小不等的隨機片段，再根據(jù)不同物種或不同品種的基因兩端的序列設(shè)計引物用PCR進行選擇性擴增。其具有DNA用量少、多態(tài)性豐富和可重復(fù)性好以及樣品適應(yīng)性廣等特點。

SNP標(biāo)記SNP是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列的多態(tài)性，包括堿基的轉(zhuǎn)換、插入及缺失等形式。SNP標(biāo)記是在1996年由美國學(xué)者Lander提出的第3代DNA分子標(biāo)記，其具有標(biāo)記密度高和遺傳穩(wěn)定性高的特點。目前，SNP標(biāo)記主要用于基因作圖、人類疾病相關(guān)基因及藥物設(shè)計研究等方面。隨著直接測序方法的進一步簡化，低耗費以及與生物芯片技術(shù)結(jié)合程度的提高，SNP標(biāo)記將成為動植物遺傳育種中較為理想的分子遺傳標(biāo)記。

3.2.2 分子遺傳標(biāo)記在動物育種的應(yīng)用 分子遺傳標(biāo)記在動物育種的應(yīng)用主要有遺傳標(biāo)記輔助選擇、數(shù)量性狀主效基因的檢測定位及建立基因庫、動物群體遺傳變異的檢測、個體和親緣關(guān)系的鑒定以及動物抗病育種等[16]。標(biāo)記輔助選擇可以在種內(nèi)和種間進行，也可對單個或多個性狀進行選擇。通過分析諸如影響家畜生產(chǎn)性能、抗病力、抗應(yīng)激反應(yīng)的數(shù)量性狀基因位點(QTL)與分子標(biāo)記的連鎖關(guān)系，確定其在染色體上的位置、單個效應(yīng)及互作效應(yīng)，從而通過選擇可識別的分子標(biāo)記來選擇具有育種意義的QTL。

近年來，研究人員在經(jīng)過長期選擇的群體中發(fā)現(xiàn)了一些對數(shù)量性狀有明顯作用的仍然處于分離狀態(tài)的單個基因，并將這些基因稱為主效基因，如牛的雙肌基因、綿羊的Booroola基因、豬的氟烷敏感基因等。目前，研究者正借助與主效基因相連鎖的分子遺傳標(biāo)記手段，從群體內(nèi)和家系內(nèi)分離鑒別主效基因，為最終定位和轉(zhuǎn)移具有重要經(jīng)濟價值的主基因篩選候選對象，并將主效基因由一個群體快速轉(zhuǎn)移，從而達到用遺傳工程的方法生產(chǎn)高生產(chǎn)性能動物品種或改良現(xiàn)有動物品種的目的。

由于分子標(biāo)記既可以揭示編碼序列的多態(tài)性，又能夠揭示更多的以非編碼序列形式存在的DNA多態(tài)性，所以作為群體內(nèi)遺傳變異的度量指標(biāo)，它可以在選種和遺傳資源保存工作中發(fā)揮重要作用。作為群體間的變異指標(biāo)，它可以揭示物種的起源、進化過程、親緣關(guān)系、基因組的同源性、基因在不同群體間的流動方向及速率以及物種之間的遺傳距離和預(yù)測不同群體間的優(yōu)勢。準確分析個體間的親緣關(guān)系對選種工作，特別是BLUP的應(yīng)用具有重要作用。據(jù)分析,依配種記錄進行牛群父系調(diào)查的錯誤率為4%～25%，而15%的錯誤鑒別率將使遺傳進展降低9%～17%[17]。

目前，國外利用分子標(biāo)記尋找抗性、易感性基因或QTL成為研究熱點，并在某些方面取得了可喜的進展。許多疾病的抗性、易感性基因、QTL以及候選基因都找到了與其緊密連鎖的分子標(biāo)記，這樣便可以通過標(biāo)記輔助選擇(MAS)進行動物的抗病育種。

4 展望

動物遺傳育種經(jīng)過表型和表型值選種；計算機技術(shù)和統(tǒng)計學(xué)方法的應(yīng)用即數(shù)量遺傳學(xué)理論研究的深入，出現(xiàn)了通過估計育種值方法選種；分子遺傳學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，出現(xiàn)了動物的分子育種。轉(zhuǎn)基因動物的研究和應(yīng)用將是21世紀生物工程技術(shù)領(lǐng)域最活躍、最具有應(yīng)用價值的項目之一，它將給人類的醫(yī)藥衛(wèi)生、生物材料、家畜改良等領(lǐng)域帶來革命性的變化，尤其凸顯的是乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物帶來的經(jīng)濟效益和社會效益。其次，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的深入和完善以及畜牧研究工作的不斷進取，利用各種分子遺傳標(biāo)記技術(shù)將對品種資源保護和合理開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，對遺傳學(xué)研究和遺傳育種將起到巨大的推動作用。

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