羅傳燦 綜述 張國梁 審校

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是多種慢性肝病進展至肝硬化的中間過程，其特征為以膠原蛋白為主的細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積于肝臟，而肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）是HF時過量ECM的主要來源，各種致HF因素均以HSC作為最終靶細胞，激活的HSC大量增殖，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，分泌過多的ECM沉積于肝臟而導致HF的發(fā)生。這一復雜的病理過程是多條細胞信號傳導通路和一系列細胞信息分子網(wǎng)絡共同控制的結(jié)果，P38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，P38 MAPK）信號傳導通路是絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK）家族的重要成員，現(xiàn)就有關(guān)研究綜述如下。

一、P38 MAPK通路在HF模型中的表達

吳文娟[1]等發(fā)現(xiàn)CCl4誘導的HF大鼠隨著肝纖維化形成程度明顯加重，P38 MAPK在mRNA水平和蛋白水平都表現(xiàn)出增加的趨勢，并且主要表達于肝臟的間質(zhì)細胞，P38 MAPK在HF的形成中持續(xù)上調(diào)，與HF程度呈顯著正相關(guān)，同時實驗免疫組化及RT-PCR結(jié)果顯示，P-P38 MAPK在正常對照組中未見陽性表達，而P38 MAPK mRNA僅有極少量表達，說明在正常生理狀態(tài)下肝組織中P38 MAPK是以無活性的非磷酸化形成存在。在HF形成中，P38 MAPK被激活，活化的P38 MAPK參與了大鼠HF形成，另外免疫組化顯示P-P38 MAPK主要表達于肝間質(zhì)細胞的胞核中，可見P38 MAPK信號傳導通路主要作用于肝間質(zhì)細胞，推測P38 MAPK信號傳導通路可能通過誘導HSC的活化、增殖促進HF的形成。Reeves等[2]發(fā)現(xiàn)，HSC轉(zhuǎn)分化中P38 MAPK作用的直接證據(jù)是其組成型活性在轉(zhuǎn)分化細胞較靜止型細胞為高，其抑制劑抑制了HSC活化。同時有學者也曾報道慢性肝損傷時P38 MAPK表達也增加，郭建紅等[3]發(fā)現(xiàn)慢性肝損傷組肝組織中P-P38 MAPK與預處理組相比明顯增強，提示慢性肝損與P38 MAPK的激活有關(guān)。以上研究顯示P38 MAPK信號通道在慢性肝損的肝組織、HF模型中與活化HSC中均表達增強，揭示了P38 MAPK信號通道在HF的形成過程中發(fā)揮著重要的作用。

二、P38 MAPK通路與促進HF發(fā)生主要相關(guān)信號分子的關(guān)系

HSC是HF時肝臟細胞中ECM的主要來源細胞。在HF形成過程中有多種細胞因子參與，其中血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子 β（transforming growth factor-β，TGF-β）、白細胞介素（interleukin，IL）、瘦素（leptin，Lep）、c-Jun 氨基末端激酶（C-Jun N-terminal kinase，JNK）是重要的HSC激活細胞因子，研究發(fā)現(xiàn)P38 MAPK通路與它們在促HF過程中具有一定的相關(guān)性，同時受到多種因素調(diào)節(jié)，在體內(nèi)形成錯綜復雜的作用網(wǎng)絡。

（一）與PDGF的關(guān)系 PDGF是強大的促細胞分裂劑，是體內(nèi)主要的促纖維化因子，在活化的HSC中，Lep、PDGF等細胞因子能通過Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活子（Janus-ac-tivated kinase-signal transducer and activator of transcriptions，JAK/STAT）途徑發(fā)揮作用，同時PDGF-BB還可通過細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）途徑，誘導活化的HSC分泌血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），間接促進內(nèi)皮細胞的生長和增殖，從而促進了HF的形成，PDGF是目前已知多肽生長因子中對HSC作用最強的有絲分裂原[4]。近年發(fā)現(xiàn)PDGF在促進HSC增殖時，可檢測到包括P38 MAPK信號蛋白的活化[5]，因此PDGF與P38 MAPK在促進HF的研究得到重視。Adachi等[6]研究發(fā)現(xiàn)PDGF-BB可呈劑量依賴性促進LI-90細胞增殖，細胞數(shù)量明顯增加，用Mn-TBAP（可清除細胞內(nèi)的活性氧）預處理LI-90細胞30min，發(fā)現(xiàn)可以明顯抑制PDGF-BB的促增殖效應，且有劑量依賴性。研究中觀察到PDGF-BB誘導星狀細胞內(nèi)表達NAD（P）H氧化酶，抑制該酶則抑制了PDGF-BB的促增殖效應，表明NAD（P）H氧化酶在PDGF-BB誘導HSC增殖中的重要作用。研究者進一步分析了PDGF-BB的作用機制ERK和P38 MAPK蛋白均被活化，然而ERK抑制劑PD98059、P38 MAPK抑制劑SB203580預處理LI-90細胞1h，發(fā)現(xiàn)SB203580組的抑制增殖效應強于PD98059組。抑制NAD（P）H氧化酶可抑制P38 MAPK活化，但對ERK無影響，H2O2與PDGF-BB共同孵育，能抵消對P38 MAPK的抑制作用。以上研究說明PDGFBB可誘導HSC細胞NAD（P）H氧化酶的表達，并生成活性氧進而通過P38 MAPK信號通路發(fā)揮促進HSC增殖的作用。Carloni V等[6]發(fā)現(xiàn)PDGF與HSC上相應的受體結(jié)合后，主要通過MAPK信號通路蛋白如ERK和P38將信號傳遞到細胞核，促進HSC的增殖。Adachi T等[8]發(fā)現(xiàn)還原型輔酶Ⅱ（NADPH）氧化酶在HSC中表達，對PDGF-BB產(chǎn)生反應后生成活性氧族（ROS），ROS通過P38 MAPK磷酸化作用使HSC增殖。

（二）與TGF-β的關(guān)系 TGF-β是一種對細胞生長、分化和多種生理、病理過程起重要調(diào)節(jié)作用的細胞因子。TGF-β因啟動、促進HSC活化而在HF形成過程中起重要作用，TGF是刺激HSC分泌ECM作用最強的細胞因子之一，在HF的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。HSC中TGF-β信號主要通過ALKS/Smad2/3途徑傳遞，然而近年的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)P38 MAPK在TGF-β介導的HSC效應中也發(fā)揮著重要的作用。Tsukada等[8]發(fā)現(xiàn)TGF-β作用HSC后，可測到P38 MAPK蛋白的表達（包含磷酸化蛋白），而用P38 MAPK的特異性阻斷劑SB203580預孵育1h，則可以阻斷TGF-β誘導的P38 MAPK蛋白活性。他們還發(fā)現(xiàn)阻斷Smad信號通路并不影響基礎(chǔ)的和TGF-β誘導的P38 MAPK活性。同樣，阻斷P38 MAPK也不影響Smad信號通路，說明P38 MAPK是TGFβ在HSC內(nèi)可獨立于Smad信號之外。同時還發(fā)現(xiàn)TGF-β依賴的P38 MAPK途徑可以上調(diào)HSC細胞外基質(zhì)的表達，如I型膠原和凝血酶敏感素-2（TSP-2）。Cao等[9]研究也顯示，雙亞麻油酸磷脂膽堿通過抑制氧化應激的產(chǎn)生及相關(guān)的H202依賴的P38 MAPK活化，阻止了TGF-β磷酸化誘導的膠原mRNA增加。Schnabl[10]也發(fā)現(xiàn) TGF-β可不依賴 TGF-β/Smad2，由P38 MAPK途徑直接激活Smad3，使其磷酸化，最終可導致ECM的沉積。TGF-β誘導Ⅰ型膠原基因的表達部分受P38 MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑調(diào)節(jié)。研究者還發(fā)現(xiàn)阻斷P38 MAPK或Smad均可降低培養(yǎng)活化的和TGF-β誘導活化的HSCα1（Ⅰ）膠原基因的表達，而同時抑制兩條通路則α1（Ⅰ）膠原基因的表達幾乎完全被阻斷，P38既獨立調(diào)節(jié)HSCα1（Ⅰ）膠原基因表達又與Smad有協(xié)同作用，研究還發(fā)現(xiàn)增加HSCα1（Ⅰ）膠原mRNA穩(wěn)定性是由P38 MAPK介導的。曾有報道表明在培養(yǎng)的肌成纖維細胞中，TGF-β可先激活P38 MAPK通路，然后進一步導致Smad3交聯(lián)區(qū)磷酸化，促使Smad3和Smad4異體復合物形成并移位核內(nèi)，結(jié)合到PAI-1啟動子促進基因的表達[11]。

（三）與IL的關(guān)系 白細胞介素（interleukin，IL）與HSC活化、增殖的相關(guān)性也是近年涉及HF研究的熱點之一，不少研究表明IL-1在促進HSC活化、增殖等過程中發(fā)揮重要作用。IL-1作用于HSC后如何使之激活并增殖，信號分子在細胞內(nèi)如何轉(zhuǎn)導是當前學者們探究的熱點問題。Zhang[12]等報道了IL-1通過對金屬蛋白酶組織抑制因子-1mRNA（TIMP-1mRNA）表達的正向調(diào)節(jié)從而對HF的形成起直接作用，MAPK通路中JNK和P38在HSC的TIMP-1RNA表達中都起了重要作用。姚希賢[13]等發(fā)現(xiàn)IL-1β有明顯促大鼠HSCⅠ型膠原合成作用，阻斷P38 MAPK通路后，IL-1β的促HSCⅠ型膠原合成作用受到抑制。經(jīng)不同濃度P38特異性阻斷劑SB203580預處理的各組細胞，3H-脯氨酸（3H-Pro）摻入量與對照組（未用SB203580預處理）相比，其摻入量均明顯降低。有學者發(fā)現(xiàn)IL-10在抑制HSC的過程與抑制P38的活性下降有關(guān)。李濤[14]等發(fā)現(xiàn)加入1ng/ml的IL-10就可以引起HSC的PDGF mRNA和蛋白表達的降低，PDGF的下游信號MAPK通路蛋白ERK和P38蛋白的表達與對照組相比顯著降低，可能和1ng/ml的IL-10劑量尚不足及信號通路的級聯(lián)放大作用有關(guān)。加大IL-10的劑量后HSC的PDGF及其下游信號蛋白ERK和P38蛋白的表達與對照組相比均顯著降低，并呈量效依賴關(guān)系，表明激活的HSC的一個重要的特征就是大量分裂增殖，而PDGF在HSC的分裂和增殖中起了關(guān)鍵作用，PDGF與HSC上相應的受體結(jié)合后，激活受體羥基端的酪氨酸激酶，通過下游的MAPK蛋白如ERK和P38將信號傳遞到核內(nèi)，促進細胞的分裂增殖。提示IL-10能通過抑制HSC激活過程中起關(guān)鍵作用的細胞因子PDGF及其下游信號蛋白ERK和P38的表達對HSC的激活過程產(chǎn)生影響。

（四）與Lep的關(guān)系 Lep是一種16U的蛋白質(zhì)，主要存在于脂肪細胞中，靜止的HSC很少表達Lep，在HSC活化時，Lep的合成和表達明顯增加[15]，它在HF形成過程中發(fā)揮重要作用?；|(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）通過抑制膠原的降解而產(chǎn)生作用，由活化的HSC合成。Cao[16]研究瘦素誘導人HSC細胞系LX-2細胞表達TIMP-1的分子機制時發(fā)現(xiàn)，Lep可磷酸化P38 MAPK蛋白并且呈劑量和時間依賴性，Lep濃度達75μg/L時效應最明顯，而在此濃度作用下2h到24h活性達峰值，約為對照組的3.6倍。進一步給予LX-2細胞JAK抑制劑AG490、過氧化氫酶、SB203580或負性P38 MAPK突變體，發(fā)現(xiàn)均可抑制P38 MAPK的活性，但ERK抑制劑PD098059沒有此效應，說明JAK和過氧化氫參與Lep誘導的LX-2細胞內(nèi)P38 MAPK途徑的活化，同時發(fā)現(xiàn)抑制P38 MAPK通路也能抑制LX-2細胞Lep誘導的TIMP-1 mRNA的表達。認為Lep與受體結(jié)合，通過JAK途徑誘發(fā)過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）產(chǎn)生，進而誘導H2O2依賴的P38 MAPK的活化，活化的P38 MAPK參與對LX-2細胞TIMP-1 mRNA的調(diào)節(jié)。進一步研究表明，H2O2激活ERK1/2和P38及JAK1和JAK2信號通路，抑制HSC基質(zhì)金屬蛋白酶-1（matrix metalloproteinases-1，MMP-1）表達，促進Ⅰ型膠原表達。有研究發(fā)現(xiàn)，二亞油酰磷脂酰膽堿（DLPC）或S-腺苷甲硫氨酸（SAMe）都能阻斷ERK1/2和P38的磷酸化，抑制TIMP-1的表達[17]。它們還能阻止Lep或甲萘醌引起的H2O2產(chǎn)生，恢復消耗的谷胱苷肽，阻斷H2O2介導的ERK1/2和P38，完全抑制Ⅰ型膠原mRNA的表達[18]。

（五）與JNK通路的關(guān)系 應激活化蛋白激酶，又稱cjun氨基末端激酶（stress-activated protein kinase/C-Jun N-terminal kinase，SAPK/JNK）是MAPK家族的重要成員，能被多種炎性刺激因子所激活，對炎癥的發(fā)生、發(fā)展起重要作用，近年發(fā)現(xiàn)在激活的HSC中呈高表達，而通過阻斷JNK通路促進HSC凋亡[19]。張一寧等[20]在探討膽汁酸調(diào)控肝星狀細胞促進HF發(fā)生機制時發(fā)現(xiàn)，甘氨鵝脫氧膽酸（GCDCA）能誘導P38及JNK磷酸化的作用導致肝星狀細胞增殖的作用，還能提高該細胞HSC的動能力，而JNK（SP600125）或P38（SB294002）的抑制因子能夠抑制膽汁酸的這種作用。Cao[21]等報道了一種肝臟纖維蛋白溶解原細胞因子來普汀，在HSC中誘導氧化應激反應，同時增加H2O2的形成，而H2O2通過MAPK通路中P38和ERK1/2通路，激活JAK1和JAK2，刺激TIMP-1的產(chǎn)生，從而刺激膠原產(chǎn)生，HF形成。

三、P38 MAPK通路抑制HSC增殖

隨著P38 MAPK通路研究的進一步深入，也有部分研究表明它在HF的形成過程中也存在負調(diào)節(jié)的作用。張亞平等[22]通過研究IL-1β上調(diào)大鼠HSCs的TIMP-1 mRNA表達與JNK和P38兩條通路在激活HSC過程中的作用，發(fā)現(xiàn)HSCs中兩條通路均可被IL-1激活，但所起作用完全不同，發(fā)現(xiàn)IL-1β刺激5min后，即見P38活化增強，30min時達到高峰，2h后則基本恢復初始水平，進一步研究發(fā)現(xiàn)阻斷JNK通路可抑制HSCs TIMP-1 mRNA的表達，而阻斷P38通路卻可提高HSCs TIMP-1 mRNA的表達，實驗結(jié)果揭示IL-1β可同時激活HSCs中JNK和P38兩條通路，盡管它們所起作用完全不同，但可相互作用共同調(diào)控TIMP-1 mRNA的表達，但JNK和P38通路相互作用的結(jié)果表現(xiàn)為上調(diào)TIMP-1 mRNA的表達。Schnabl[10]通過研究阻斷TAK1/JNK和P38 MAPK信號通路后對HSC的影響，發(fā)現(xiàn)阻斷P38 MAPK可減少α1（Ⅰ）型膠原mRNA的表達，但促進HSC的增殖，而阻斷TAK1/JNK則起相反的作用，由此可以看出活化的P38 MAPK信號通路有抑制HSC增殖、增加膠原生成的功能。王聰?shù)萚23]在研究硫化氫在大鼠肝星狀細胞氧應激中的作用時，通過鐵超載促進HSC增殖復制肝纖維化模型發(fā)現(xiàn)激活的HSC中H2S含量減少、P38表達下調(diào)。給予外源性硫化氫供體硫氫化鈉能后細胞增殖減慢，使P38表達上調(diào)，緩解HSC增殖。給予內(nèi)源性H2S作用的KATP通道阻滯劑GLBN（格列苯脲）后H2S含量進一步下降，P38表達進一步下調(diào)，HSC增殖加劇，從而發(fā)現(xiàn)氧應激下H2S通過P38基因表達水平的調(diào)控對HSC細胞產(chǎn)生保護作用，可抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。

四、小結(jié)

P38 MAPK信號通路參與了對HSC的活化增殖、合成膠原的調(diào)節(jié)，與 PDGF、TGF-β、IL、Lep、JNK 等多種細胞因子共同參與促進HSC激活、增殖、并合成、分泌細胞外ECM等多種物質(zhì)，使ECM合成與降解失衡，在肝臟內(nèi)過度沉積，肝臟結(jié)構(gòu)改變，導致HF，但有部分研究表明其在對HSC起負調(diào)節(jié)作用，可見HSC的激活、增殖是一個有多種細胞因子、多種細胞信號轉(zhuǎn)導通路參與的復雜的病理生理過程，P38 MAPK可能與細胞內(nèi)其他的信號通路產(chǎn)生交叉，使作用機制更趨復雜，而多項研究表明P38 MAPK是其中極其重要組成部分。針對P38 MAPK信號傳導通路的研究不僅有助于更深入地探討HF發(fā)病的分子機制，為HF的防治研究提供更多積極有效的干預措施與方法。

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