鞏 凡，張 焱，白志剛，牛東生*

(1寧夏醫(yī)科大學，銀川 750004;2寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院)

激素性股骨頭缺血性壞死(SANFH)是因為大量應用皮質類固醇類激素，造成股骨頭內骨細胞、血管內皮細胞等死亡或凋亡所引起的病理過程。骨髓間充質干細胞 (BMSCs)是一種主要存在于骨髓中，具有多向分化能力的干細胞。2010年 3月，我們觀察了兔 SANFH模型的 BMSCs的超微結構，探討SANFH的成因及對骨修復的影響機制。

1 材料和方法

1.1 材料 健康成年新西蘭大白兔 10只(體質量2.5～3.0 kg，由寧夏醫(yī)科大學動物試驗中心提供);馬血清(鄭州益康生物工程有限公司);醋酸潑尼松龍(25 mg/ml，中國浙江仙據(jù)制藥股份有限公司);青霉素鈉:0.48 g(80萬 U，石藥集團中諾藥業(yè)有限公司);Percoll細胞分離液(Pharmacia 1.073 g/ml);L-DMEM(Gibco公司);PBS(Sigma公司 );肝素鈉注射液(12 500 U/2 ml，江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備 參考相關文獻[1]，10只健康的成年新西蘭大白兔分籠喂養(yǎng)，適應性飼養(yǎng) 3 d后每只經耳緣靜脈注射馬血清 10 ml/kg 1次，間隔兩周后再注射 1次。繼續(xù)喂養(yǎng)兩周后肌肉注射醋酸潑尼松龍 8 mg/kg，間隔 1 d注射 1次，共 5次。繼續(xù)喂養(yǎng) 3～5周后行 X線檢查，觀察結果。結果發(fā)現(xiàn)骨小梁中出現(xiàn)大量空骨陷窩及核固縮現(xiàn)象，符合激素性股骨頭缺血性壞死的病理學定義[2，3]，說明制模成功。為預防感染，所有試驗動物每周給予肌肉注射青霉素鈉 20萬 U/只。

1.2.2 細胞分離及超微結構觀察 予制模前及制模后 2個月行骨髓細胞分離:將新西蘭大白兔俯臥位固定于手術臺上，3%戊巴比妥鈉 1 ml/kg(30 mg/kg)耳緣靜脈緩慢注射麻醉，備皮，碘伏消毒皮膚。選取股骨近端外側將 F16骨髓穿刺針定位，待骨髓穿刺針有明顯落空感時，抽出穿刺針內芯，于穿刺針尾部接入 10 ml注射器(內含 12 500 U肝素 1 ml)負壓抽吸，每次穿刺抽取 5 ml骨髓液。抽取的骨髓立刻進入無菌間，與等體積的不含血清的 L-DMEM培養(yǎng)基混勻，500 r/min離心 5 min，棄上清液，用 5.0 ml不含血清的 L-DMEM培養(yǎng)基混勻，緩慢加入預先加有 5.0 ml密度為 1.073 g/ml的 Percoll分離液的離心管內，使其位于 Percoll分離液的液面上，靜置 5 min，1 500 r/min離心 30 min?？梢姽軆纫后w分為四層，最上層約占液柱的 1/2，為紅色的培養(yǎng)液層，第三層約占液柱的 1/2，為乳白色的 Percoll分離液層，兩層交界處為高約 1.0 mm的灰白色云霧狀層，為單個核細胞層，底層緊貼試管壁，為一薄層紅色細胞層，為紅細胞等。小心吸去最上層的紅色培養(yǎng)液，緩慢加入 2%戊二醛固定 2 h(4℃)，待灰白色云霧層固定成塊后，小心將固定塊挑出，放入小瓶中，4℃、2%戊二醛繼續(xù)固定 30 min，換 0.1 M二甲砷酸鈉緩沖液沖洗 3次，0.1 M二甲砷酸鈉緩沖液保存(4℃)。1%鋨酸浸泡染色 2 h(4℃)。梯度乙醇脫水。環(huán)氧丙烷滲透 2次。完全樹脂包埋后入模具。修整模塊，切片，定位，超薄切片，于電鏡下觀察細胞超微結構變化。

2 結果

制模前 BMSCs:低倍下見少量紅細胞及兩個并排的 BMSCs，細胞核較大核膜完整;細胞質豐富，電子密度均一，細胞器結構清晰。并可見另一 BMSCs，細胞質濃縮聚集，核膜不完整;細胞質電子密度增高，其間細胞器結構不清。高倍下見雙層核膜完整，細胞核較大，染色質分布均勻，核內染色質豐富，核孔較多;細胞質豐富，電子密度均一，細胞器豐富，線粒體、內質網等細胞器結構清晰。制模后 BMSCs:低倍下見少量紅細胞及一個淋巴細胞。其中可見兩個細胞出現(xiàn)染色質濃縮、聚集并出現(xiàn)凋亡小體。高倍下見胞體變小，胞質基質密度增加。細胞核不完整，核膜模糊，染色質固縮、凝集;細胞質濃縮，電子密度增高，胞質內見大小不等的空泡及大量脂滴，細胞器結構不清。

3 討論

BMSCs能夠分化為多種組織細胞，包括骨、軟骨、脂肪、肌腱細胞等。關于激素性股骨頭缺血性壞死的致病原因，目前尚有爭議，其中以骨質疏松、血液高凝狀態(tài)、血管內凝血、脂肪代謝紊亂、骨內高壓等較為普遍。激素性股骨頭缺血性壞死的致病過程極其復雜[2]，上述原因并不是孤立存在，而是相互聯(lián)系。其中脂肪代謝紊亂學說認為與激素導致骨髓內脂肪細胞聚集、肥大有關[3]。研究發(fā)現(xiàn)，動物應用激素后股骨頭內脂肪細胞肥大，并見大的脂肪滴形成;而脂肪滴旁發(fā)現(xiàn)的間充質干細胞普遍出現(xiàn)功能障礙的特征:①胞質內空泡形成:可能是線粒體和內質網腫脹所致，說明細胞有氧呼吸及蛋白合成可能受到干擾;②自噬體出現(xiàn):提示細胞出現(xiàn)衰老;③胞質內大量脂滴出現(xiàn):說明細胞的脂類代謝功能可能受到影響。本研究結果顯示，應用激素前只有少量 BMSCs出現(xiàn)了凋亡，此與成年動物細胞正常衰老有關。應用激素后大量的 BMSCs出現(xiàn)凋亡或細胞器受損，胞質中看到空泡和大量脂滴形成，提示激素可能通過影響細胞的正常脂類代謝使其過早出現(xiàn)功能異常，并可能引發(fā)其啟動凋亡程序，此進一步印證了 Wang等[4]的研究，他們發(fā)現(xiàn)大量使用糖皮質激素可以使BMSCs減少;其在對成骨細胞的觀察中胞質內沒有發(fā)現(xiàn)脂滴，僅看到腫脹的線粒體及自噬體，證明有氧呼吸被干擾沒有引起脂類代謝紊亂。

本研究中采用 Percoll細胞分離液分離 BMSCs后不經培養(yǎng)，直接固定，減少了細胞培養(yǎng)對細胞狀態(tài)的影響及各種人工培養(yǎng)液對細胞器的損害，觀察到的細胞狀態(tài)更符合其體內狀態(tài)，結果與喬東訪等[5]體外培養(yǎng)的兔 BMSCs觀察結果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，激素導致股骨頭缺血壞死的可能機制為通過對血液系統(tǒng)的干擾，影響股骨頭內各種細胞的有氧呼吸;又通過干擾 BMSCs的脂類代謝影響骨的修復，最終導致股骨頭壞死塌陷。

[1]李子榮，張念非，岳德波，等.激素性股骨頭壞死動物模型的誘導和觀察[J].中華外科雜志，1995，33(8):485-487.

[2]Mont MA，Jones LC，Elias JJ，et al.Strut-autograft with and without osteogenic protein-l:a primary study of a canine of femoral head defect model[J].J Bone Joint Surg Am，2001，83(7):1013-1022.

[3]Wang GJ，Lennox DW，Rteven SL，et al.Cortisone-in-duced intra femoral head pressure change and its response to a drilling decompression method[J].Clip Ortho Relat Res，1981，(159):274-278.

[4]Wang BL，Sun W，Shi ZC，et al.Decreased proliferation of mesenchymal stem cells in corticosteroid-induced osteonecrosis of femoral head[J].Orthopedics，2008，31(5):444.

[5]喬東訪，路艷蒙，傅文玉，等.體外培養(yǎng)兔骨髓間充質干細胞的超微結構觀察[J].電子顯微學報，2002，21(5):491-492.