劉艷紅,章秀麗,陳少文,趙燕穎

(1.深圳市蛇口人民醫(yī)院,廣東深圳 518067;2.吉林大學第四醫(yī)院,吉林 長春 130011）

人參具有抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、增強免疫力等多種生物學活性。人參皂苷是人參中主要的活性成分。人參皂苷單體Rh2(G-Rh2）是從紅參中分離得到的原人參二醇型單糖鏈皂苷單體化合物,在一些腫瘤細胞體外培養(yǎng)系中觀察到其對腫瘤細胞增殖的抑制作用[1-5],并初步探討該過程與誘導細胞凋亡及阻滯細胞周期等有關(guān)。而目前缺少關(guān)于G-Rh2對肝癌細胞增殖抑制及其相關(guān)分子機制的研究報道。本研究以人肝癌細胞株HepG2為研究對象,觀察不同濃度G-Rh2誘導肝癌細胞凋亡的作用,并初步探討其分子機制。

1 材料與方法

1.1 試劑G-Rh2由吉林大學分析化學教研室提供,純度大于99%;1640培養(yǎng)基和新生小牛血清(FBS）購自杭州四季青生物有限公司;MTT購自Sigma公司。survivin引物由上海生工生物技術(shù)公司合成,Trizol試劑,M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,PCR試劑盒均購自Invitrogen公司,紫外凝膠顯像儀(美國）。

1.2 細胞來源及培養(yǎng)人肝癌細胞系(HepG2）細胞購自于上海中科院細胞庫室,經(jīng)常規(guī)復蘇后培養(yǎng)和維持在體積分數(shù)為10%FBS的1640培養(yǎng)液里,置CO2培養(yǎng)箱(37℃,5%CO2）培養(yǎng),取對數(shù)生長期細胞經(jīng)24 h無血清培養(yǎng)后,分組進行實驗。

1.3 MTT法檢測細胞生長抑制取對數(shù)生長期細胞以密度為3×105/ml,接種于96孔培養(yǎng)板、每孔100 μ l。細胞貼壁后隨機分組 ,空白組、G-Rh2(5、10、20 mg/L）組 ,G-Rh2(10 mg/L）給藥 24、48、72 h組。每一濃度均設(shè)3個復孔,同時設(shè)有對照孔。培養(yǎng)結(jié)束前加MTT(5 g/L）15 μ l,繼續(xù)孵育4 h后每孔加 150 μ l DMSO,震蕩 10 min,用酶標儀測定 570 nm各孔光吸收值(A值）。計算細胞生長抑制率,抑制率≥30%為細胞對該藥敏感。細胞生長抑制率(%）=(1-加藥組A值/對照組A值）×100%

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡及周期對數(shù)生長期細胞經(jīng)0.25%胰酶消化后傳代接種于培養(yǎng)瓶中,每瓶細胞1×106,24 h后加藥,G-Rh2終濃度為5 mg/L、10 mg/L和 20 mg/L,對照組加等體積PBS,各瓶終體積為4 ml,72 h后收集各組細胞,用冷PBS(pH 7.2）清洗2次,70%的冷乙醇4℃固定24 h。用FACStarpous流式細胞儀檢測,計算凋亡率和各期細胞所占比例。

1.5 RT-PCR檢測基因變化對數(shù)生長期細胞按每瓶細胞1×106接種,24 h后向后兩組細胞加藥(分組同1.4）,繼續(xù)培養(yǎng)72 h后收集全部四組細胞,按Trizol操作說明,提取RNA,紫外分光光度計定量。RNA樣品經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA,然后進行PCR擴增,以GAPDH為內(nèi)參,觀察survivin mRNA表達情況。survivin擴增產(chǎn)物為466 bp:上游引物為5′-TTGGCAGGTGCCTGTTGAAT-3′;下 游 引 物 為 5′-AGCCAGTCCCCCACAGCAT-3′。GAPDH 擴增產(chǎn)物為309 bp,上游引物為 :5′-GG2 GAAACTGTGGCGTGAT-3′下游引 物為 :5′-AAAGGTGGAG2 GAGTGGGT-3′。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠系統(tǒng)電泳(含溴化 乙啶）,拍照鑒定和分析。

1.6 統(tǒng)計學處理采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理,使用 χ2檢驗進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 G-Rh2對HepG2細胞增殖的影響對照組細胞體外生長活躍,經(jīng)5、10及20mg/L G-Rh2作用后,HepG2細胞增殖均有不同程度受到抑制,與陰性對照組比較差異具有顯著性(P＜0.01）,且Rh2對肝癌HepG2細胞生長抑制影響呈劑量依賴性,和時間依賴性。增殖抑制率隨著G-Rh2劑量增加而增加;加用10 mg/L G-Rh2后24、48及72 h的細胞增殖抑制率隨時間延長而增加。如圖1。

圖1 G-Rh2對hepG2細胞的增殖抑制作用

2.2 G-Rh2對HepG2細胞周期及凋亡率的影響3種濃度的G-Rh2作用HepG2細胞72 h后,可影響細胞周期分布,G0/G1期和G2/M期細胞百分比上升,S期細胞百分比下降,細胞凋亡率隨藥物劑量增加而逐漸增加,詳見表1。

2.3 G-Rh2對HepG2細胞survivin mRNA表達的影響Survivin和GAPDH擴增片段長度分別為466 bp和309 bp。5,10,20 mg/L G-Rh2組 survivin表達抑制率為41.02%,61.16%和88.69%。對survivin基因表達抑制率隨G-Rh2劑量增加而增加,詳見圖2。

表1 G-Rh2作用HepG2細胞后細胞周期和凋亡率的變化(n=4,±s）

表1 G-Rh2作用HepG2細胞后細胞周期和凋亡率的變化(n=4,±s）

*P＜0.05 VS control

細胞周期 G0/G1 S G2/M 凋亡率(%）別 組control 57.3±1.1 21.6±3.2 21.1±0.8 4.0±0.19 5 mg/L 59.5±0.9 16.2±2.9 24.3±1.1* 19.5±2.02*10 mg/L 60.9±0.6 11.6±3.1 27.5±2.1* 26.8±3.11*20 mg/L 63.2±1.1 4.9±3.7 31.9±1.1* 46.9±2.12*

圖2 G-Rh2對hepG2細胞的survivin mRNA表達的影響

3 討論

人參皂苷是人參的主要活性成分,在人參皂苷單體中G-Rh2的抑瘤活性最強,體內(nèi)外實驗結(jié)果表明G-Rh2時間和劑量依賴性地抑制宮頸癌[6]、腦膠質(zhì)瘤[7]、肺癌[8]等多種腫瘤細胞的增殖,且其誘導凋亡與抑制增殖呈正相關(guān),但目前未見G-Rh2對人肝癌細胞HepG2增殖抑制作用的研究。Kim等[9]研究表明G-Rh2有誘導小鼠膠質(zhì)瘤細胞凋亡的作用。馬文彬等應用流式細胞儀研究G-Rh2對S180肉瘤細胞周期移行的影響,發(fā)現(xiàn)GS-Rh2能引起細胞周期阻滯于S期。為進一步探討G-Rh2抑制細胞生長的機理,我們檢測了G-Rh2作用后HepG2細胞凋亡率(AR）以及細胞周期變化。結(jié)果顯示本實驗結(jié)果表明G-Rh2可以使腫瘤細胞周期阻滯,G1期細胞增多,S期細胞減少,G2/M期細胞相對增多,抑制細胞G1期的RNA合成,從而延緩腫瘤細胞的增殖,GRh2可使HepG2細胞G1期阻滯,不能進入S期,阻滯G1期細胞向S期的轉(zhuǎn)化進程,從而使G2/M期細胞相對增多。HepG2細胞的凋亡率在一定范圍內(nèi)具有隨藥物濃度增高而增高的趨勢。由此提示:在一定范圍內(nèi),G-Rh2誘導細胞凋亡呈劑量依賴性和時間依賴性。

Survivin是新近發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制蛋白(inhibition apoptosis protein,IAP）,在正常組織、終末分化組織中表達陰性,而在絕大多數(shù)腫瘤組織中表達 陽性,與腫瘤的預后密切相關(guān)[10-12]。其作用機制與IAP家族的其他蛋白相似,系通過抑制caspase-3和7酶原的活性,抑制細胞凋亡;另外,Survivin還通過與紡錘體纖維的結(jié)合,間接地抑制caspase酶對紡錘體的水解作用,保護有絲分裂細胞器的完整性,發(fā)揮抑制細胞的凋亡的作用。本實驗結(jié)果證實,GS-Rh2能抑制肝癌HepG2細胞Survivin基因的表達,而且隨著藥物濃度的增加,對Survivin基因的表達的抑制作用也增加。G-Rh2在體外對肝癌細胞HepG2有明顯的增殖抑制作用和凋亡誘導作用,初步推斷其對survivin mRNA表達的抑制可能是G-Rh2誘發(fā)肝癌細胞凋亡的主要原因之一。但對其作用機理仍需進一步的探討。

[1]Ham YM,Choi J S,Chun K H,et al.The c2Jun N2terminal kinase 1 activity is differentially regulated by specific mechanisms during apop tosis[J].J Biol Chem,2003,278(50）:50330.

[2]Oh J I,Chun K H,Joo S H,et al.Caspase232dependent p rotein ki2 nase C delta activity is required for the p rogression of ginsenoside2 Rh2 2induced apop tosis in SK2HEP21 cells[J].Cancer lett,2005,230(2）:228.

[3]Musende AG,Eberding A,Jia W,et al.Rh2 orits aglycone aPPD in combination with docetaxel for treatment of prostate cancer[J].Prostate,2010,70(13）:1437.

[4]Cheng C C,Yang SM,Huang C Y,et al.Molecularmechanisms of ginsenoside Rh2 2mediated G1 growth arrest and apop tosis in human lung adenocarcinoma A549 cells[J].Cancer Chem other Pharm,2005,55(6）:531.[5]Liu J,Shimizu K,Yu H,et al.Stereospecificity of hydroxyl group at C-20 in antiproliferative action of ginsenoside Rh2 on prostate cancer cells[J].Fitoterapia,2010,81(7）:902.

[6]Ham YM,Choi J S,Chun K H,et al.The c2Jun N2terminal kinase 1 activity is differentially regulated by specific mechanisms during apop tosis[J].J Biol Chem,2003,278(50）:503.

[7]Park EK,Lee EJ,Lee SH,Induction of apoptosis by the ginsenoside Rh2 by internalizationof lipid rafts and caveolae and inactivation of Akt[J].Br J Pharmacol,2010,160(5）:1212.

[8]Cheng C C,Yang SM,Huang C Y,et al.Molecularmechanisms of ginsenoside Rh2 2mediated G1 growth arrest and apop tosis in human lung adenocarcinoma A549 cells[J].Cancer Chem other Pharm,2005,55(6）:531.[9]Kim TW,Choi HJ,Kim NJ,et al.Anxiolytic-like effects of ginsenosides Rg3 and Rh2 from redginseng in the elevated plus-maze model[J].Planta Med,2009,75(8）:836.

[10]KANNANGAI R,WANG J,LIU QZ,et al.Survivin over expression in hepatocellular carcinoma is associated with p53 dysregulation[J].Int J Gastrointest Cancer,2005,35(1）:53.

[11]劉乃政,王紀敏,司 磊,等.血清survivin抗體及mRNA含量檢測對肺癌診斷價值研究[J].中國實驗診斷學,2010,14(7）:1042.

[12]SAH NK,KHAN Z,KHAN GJ,et al.Structural,functional and therapeutic biology of survivin[J].Cancer Letters,2006,244(2）:164.