徐為民,曹 振,蘇 青,高長(zhǎng)斌*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 老年病科,吉林長(zhǎng)春 130033;2.長(zhǎng)春市口腔醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春 130022;3.吉林大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)藥理與毒理教研室,吉林長(zhǎng)春 130021）

心肌纖維化(myocardial fibrosis,MF）系指在正常心肌組織中膠原纖維(心肌細(xì)胞外基質(zhì)主要成分）大量積聚,膠原濃度明顯升高或膠原成分發(fā)生改變[1]。研究表明:MF是多種心臟疾病發(fā)展到一定階段的共同病理改變,是心血管系統(tǒng)疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]。尾加壓素(urotensin,UII）是迄今所知最強(qiáng)的縮血管活性肽,其縮血管作用較內(nèi)皮素高10倍以上[3]。體外研究中發(fā)現(xiàn)尾加壓素Ⅱ可促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖并促進(jìn)Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖維聯(lián)結(jié)蛋白表達(dá),提示尾加壓素Ⅱ在心肌纖維化過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用[4,5],然而體內(nèi)研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)注射鹽酸異丙腎上腺素(isoproterenol,Iso）復(fù)制大鼠心肌纖維化模型,從基因和蛋白表達(dá)水平研究UII在大鼠心肌纖維化中的表達(dá)情況,以進(jìn)一步探討其在MF的發(fā)生發(fā)展關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器鹽酸異丙腎上腺素注射液(由上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn),Iso）;羊抗大鼠UII單克隆抗體(由santa cruz公司提供）;SP-9000免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒(由北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司提供）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組雄性Wistar大鼠20只,體重180-220 g,由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。分為正常對(duì)照組及Iso組(包括12 h、1周及3周組）。

1.3 Masson三色染色評(píng)估細(xì)胞外基質(zhì)含量細(xì)胞外基質(zhì)經(jīng)染色后表現(xiàn)為蘭色,病理圖像分析系統(tǒng)分析陽(yáng)性信號(hào)吸光度(A）。

1.4 UII蛋白組織化學(xué)染色嚴(yán)格按SP-9000免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。染色后在每張切片左心室尖部,隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(×200）,用病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)所選視野內(nèi)陽(yáng)性信號(hào)進(jìn)行圖像分析,計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)的各組大鼠心肌組織陽(yáng)性信號(hào)吸光度(A）。

1.5 半定量RT-PCR檢測(cè)UII mRNA表達(dá)GAPDH內(nèi)參基因上游5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3',下游5'-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3';UII:Sense:5'-TGC CTG CTC TTC GTA GGA CT-3'Anti-sense:5'-AGA GCC TTC CTC AAG CTT CC-3',擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為452 bp和603 bp。UII表達(dá)量以UII與GAPDH吸光度(A）之比來(lái)表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。UII的表達(dá)量用ˉx±s表示,組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 HE染色組織學(xué)變化

正常大鼠心肌纖維排列整齊,胞核明顯,無(wú)細(xì)胞腫脹。注射Iso 12 h后,心肌出現(xiàn)散在壞死灶,局限于心內(nèi)膜下。1周后,出現(xiàn)界限清晰、多發(fā)壞死灶,心肌可見一定的膠原纖維。3周后,壞死病灶可見明顯纖維化。

2.2 Masson三色染色細(xì)胞外基質(zhì)經(jīng)染色后表現(xiàn)為蘭色。正常對(duì)照組心肌細(xì)胞外基質(zhì)含量較少;注射Iso 1 W后,含量即明顯增加(P＜0.01）。3周最為明顯,圖像分析結(jié)果見表1。

表1 心肌組織中膠原、UII基因和蛋白表達(dá)

2.3 UII免疫組織化學(xué)染色UII免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:正常對(duì)照組在心尖及心內(nèi)膜可見極少量陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。注射Iso 12 h后,UII陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物即有所增加。注射1周后,UII陽(yáng)性產(chǎn)物增加明顯,呈黃褐色(P＜0.01）。注射3周后,UII陽(yáng)性產(chǎn)物呈黃褐色,且表達(dá)明顯比1周多(P＜0.01）且多分布在壞死灶周圍,結(jié)果見表1及圖1。

圖1 UII免疫染色結(jié)果(×200）

2.4 UII mRNA表達(dá)情況RT-PCR結(jié)果顯示,注射Iso 12 h后,UII mRNA表達(dá)最為明顯,1周有所下降但仍高于正常對(duì)照組(P＜0.01）,3周后仍未恢復(fù)到正常水平(P＜0.05）。見表1及圖2。

圖2 UII mRNA在心肌組織中的表達(dá)

3 討論

UII是在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的生長(zhǎng)抑素樣環(huán)肽,是繼ET-1之后又一新的強(qiáng)力縮血管活性肽,其分布具有種屬普遍性,UII及受體主要分布在神經(jīng)系統(tǒng)、心血管和腎臟等組織[5]。除縮血管活性外,UII還是一種強(qiáng)烈的內(nèi)源性絲裂原,能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞和氣道平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞的增殖,從而加速疾病的發(fā)生和發(fā)展[6]。多項(xiàng)體外研究顯示尾加壓素Ⅱ可促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖膠原表達(dá),并且該增殖作用可被UII受體拮抗劑SB2611812完全阻斷,并且該受體阻斷劑治療冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后心肌重塑大鼠8周后,心肌纖維性膠原沉積明顯減少[7],由此我們認(rèn)為,UII極有可能參與心肌纖維化的發(fā)病過(guò)程。

為進(jìn)一步驗(yàn)證,本實(shí)驗(yàn)采用多點(diǎn)皮下注射Iso復(fù)制大鼠缺血缺氧性心肌壞死模型,重點(diǎn)觀察壞死灶與纖維灶UII表達(dá)水平。造模后的動(dòng)物注射Iso 12 h后即出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死,隨時(shí)間的延長(zhǎng)缺血壞死面積明顯增加,3周時(shí)已出現(xiàn)明顯的纖維化。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)及RT-PCR方法,對(duì)Iso所致MF發(fā)生發(fā)展過(guò)程中UII蛋白表達(dá)水平及mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了觀察。結(jié)果表明:多點(diǎn)皮下注射Iso后12 h UII mRNA及蛋白表達(dá)即增高,特別是mRNA,且這種增高明顯早于纖維化的發(fā)生。盡管UII mRNA的表達(dá)于1周逐漸下降,但3周后仍未恢復(fù)到正常水平,而且UII蛋白表達(dá)水平仍然隨著纖維化程度的加重穩(wěn)步增高,提示UII可能參與大鼠MF發(fā)生及發(fā)展過(guò)程。UII的促纖維化作用可能與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor beta1,TGF-β1）有關(guān),研究顯示尾加壓素 Ⅱ能夠促進(jìn)TGF-β1表達(dá),而TGF-β1抗體能抑制UⅡ?qū)w外培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞的促膠原合成作用[8],其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

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