廖 艷,袁晟光,廖維甲*,覃理靈,梅銘惠,陳 謙

(1.桂林市疾病預(yù)防控制中心,廣西桂林 541001;2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科研究室）

生存素(survivin）是近年來發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAP）家族新成員,在多數(shù)惡性腫瘤組織中表達(dá)豐富,但在相應(yīng)正常成人組織中低表達(dá)或不表達(dá),這種選擇性表達(dá)特性使其成為惡性腫瘤診斷和治療的新靶點(diǎn)[1]。Zhu等[2]及筆者課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌(HCC）組織中存在survivin的高表達(dá)[3]。RNA干擾技術(shù)(RNA interfering,RNAi）是近年來迅速發(fā)展起來的生物技術(shù),已成為基因功能研究以及基因治療的強(qiáng)有力工具[4,5]。RNAi技術(shù)在疾病的基因治療上具有光明的應(yīng)用前景,如腫瘤以及病毒感染等。因此,我們利用siRNA建立起一種轉(zhuǎn)錄后沉默(PTGS）的小分子干擾RNA(small interfering RNA,siRNA）來沉默肝癌細(xì)胞中survivin表達(dá)的方法,對腫瘤細(xì)胞生長的影響,為腫瘤的基因治療提供新的方法和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料肝癌細(xì)胞系BEL-7404為北京大學(xué)肝病研究所惠贈,E.coli菌為本實(shí)驗(yàn)室保存;DEME、Trypsin-EDTA、G418、胎牛血清和卡鈉霉素購自GIB-CO公司;脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000和TRIzol購自Invitrogn公司;LB培養(yǎng)基、內(nèi)切酶HindⅢ、BamHⅠ、TaqDNA聚合酶和DNA maker等酶購自華美生物工程公司;PCR試劑盒購自寶生物工程有限公司;甲基噻唑藍(lán)(MTT）和二甲基亞砜(DMSO）購于Sigma公司;引物由上海生物工程公司合成;小鼠抗人Survivin單抗、羊抗小鼠IgG和DAB顯色試制盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司;質(zhì)粒抽提試劑盒購自北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司。

1.2 設(shè)計(jì)合成pGenesil-1/Survivin載體的DNA片段pGenesil-1/survivin表達(dá)載體合成及細(xì)胞轉(zhuǎn)染參照Harborth等[6]的干涉 RNA設(shè)計(jì)原則,和survivin(NM_001168）編碼序列,并利用 BLAST進(jìn)行查詢,確定并特異性設(shè)計(jì)合成2對survivin編碼的siRNA序列,目標(biāo)基因序列為:GGACCACCGCATCTCTACA;設(shè)計(jì)合成siRNA干擾的目標(biāo)基因序列:正義鏈(sense）的序列為 :5′-CACCGGACCACCGCATCTCTACATT CAAGACGTGTAGAGATGCGGTGGTCCTTTTTTG-3′,反義鏈(antisense）的序列為:

3′-GGACCACCGCATCTCTACATTCAAGACGTGTAGAGATGCGGTGGTCCTTTTTTGAGCT-5′;

設(shè)計(jì)合成siRNA干擾的陰性對照基因序列:sense序列為:

5′-AGCTTGTCGACAAAAAAGACTTCATAAGGCGCATGCCGTCTTGAAGCATGCGCCTTATGAAGTCG-3′,antisense序列為:

3′-TGTCGACAAAAAAGACTTCAAAGGCGCATGCCGTCTTGAAGCATGCGCCTTATGAAGTCGGATC-5′。此互補(bǔ)序列為兩條反向重復(fù)序列,兩端分別帶有HindⅢ和BamHⅠ的酶切位點(diǎn),便于與pGenesil-1載體連接。用T4DNA連接酶將survivin-siRNA與pGenesil-1定向連接后轉(zhuǎn)化E.coli菌,用含有卡拉霉素的選擇性LB固體培養(yǎng)基鋪平板37℃培養(yǎng)過夜,分別挑出單菌落37℃搖床培養(yǎng)過夜,抽提質(zhì)粒DNA并進(jìn)行序列分析。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系BEL-7404常規(guī)培養(yǎng)于含100 ml/L的胎牛血清,100 g/L青霉素,100 g/L的鏈霉素的DEME培養(yǎng)液中,培養(yǎng)條件為37℃,CO2的濃度為50 ml/L,定勤觀察細(xì)胞生長情況,每2 d用2.5 g/L的Trypsin-EDTA消化,進(jìn)行轉(zhuǎn)代培養(yǎng)。將BEL-7404細(xì)胞轉(zhuǎn)入6孔板中培養(yǎng),設(shè)空白組、脂質(zhì)體組、siRNA陰性對照組、siRNA組等4組。待細(xì)胞融合達(dá)70%左右時(shí),換為無血清培養(yǎng)液,并按LipofectamineTM2000脂質(zhì)體的說明書以siRNA表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染BEL-7404細(xì)胞,同時(shí)設(shè)立不轉(zhuǎn)染載體的空白組和脂質(zhì)體組。轉(zhuǎn)染48 h后,更換為含100ml/L的胎牛血清G418選擇培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,更換濃度為800 mg/L的G418選擇培養(yǎng)液進(jìn)行篩選,培養(yǎng)3 d,更換濃度為200 mg/L的G418選擇培養(yǎng)基,每3 d更換一次選擇培養(yǎng)基;挑選單克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng);用TRIzol試劑盒提取細(xì)胞總RNA,部分用于免疫組化檢測。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測survivin mRNA的表達(dá)按照TRIzol試劑盒方法操作,提取細(xì)胞總RNA溶于20 μ l DEPC水,經(jīng)紫外分光光度儀定量,總RNA通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank的相應(yīng)cDNA序列,運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)survivin和β-Actin引物序列,并經(jīng)Pubmed Blast對比核對,所設(shè)計(jì)的引物序列均具有較好的特異性。survivin引物設(shè)計(jì)為:上游:5'-ATGGGTGCCCCGACGTTG-3',下游:5'-AGAGGCCTCAATCCATGG-3',擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為:436 bp。同時(shí)以 β-actin:上游 :5′-TCAC2CCACACTGTGCCCATCTACGA-3′,下游:5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′為反應(yīng)內(nèi)參照(擴(kuò)增片段的大小為:400 bp）。反應(yīng)體系如下 :總體積 20 μ l,SYBR Premix Ex Taq 10 μ l,引物(10 μ mol/L）各 0.4 μ l,DNA 2 μ l,ddH2O 7.2 μ l,混勻試劑,離心后放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。對照組和實(shí)驗(yàn)組基因的表達(dá)水平按以下方法進(jìn)行計(jì)算。Surviving-Δ Ct=平均survivin-Ct-平 均 β-actin-Ct;Surviving-Δ Δ Ct=surviving-Δ Ct-實(shí)驗(yàn)組-surviving-Δ Ct空白組;空白組和實(shí)驗(yàn)組中的待測基因的倍數(shù)關(guān)系用2-survivinΔΔCt來計(jì)算[7]。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測先將培養(yǎng)細(xì)胞用PBS洗3次,冷丙酮固定 10 min后,1%TritonX100處理 20 min。3%過氧化氫溶液浸泡10 min,正常小牛血清,37℃孵育20 min。加入一抗,4℃冰箱孵育過夜,加入二抗,37℃30 min;DAB顯色,鏡下控制;蘇木素復(fù)染1-2 min。survivin蛋白陽性染色呈棕黃色,主要定位于細(xì)胞質(zhì)。光鏡下計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞中survivin蛋白陽性染色的細(xì)胞數(shù),計(jì)算survivin蛋白陽性細(xì)胞率。

1.6 MTT法檢測survivin-siRNA轉(zhuǎn)染對BEL-7404細(xì)胞影響取各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染BEL-7404細(xì)胞,配制單個(gè)細(xì)胞懸液,以每孔2×105細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板,每組3孔,每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔,在培養(yǎng)24、48、72 h 后每孔加入 5 g/L 的MTT 溶液 20 μ l,37℃溫育 4 h,棄上清 ,每孔加入 DMSO 100 μ l震蕩10 min,酶標(biāo)儀下450 nm波長測OD值,根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞抑制率:細(xì)胞抑制率=(空白組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/空白組OD值×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量資料均采用 ˉx±s表示,兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SiRNA轉(zhuǎn)染后對細(xì)胞株BEL-7404細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染24 h后,BEL-7404細(xì)胞形態(tài)變圓、細(xì)胞體積大小不等、漂浮細(xì)胞增多等凋亡改變,而siRNA陰性對照組、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組和空白組僅有少量細(xì)胞出現(xiàn)漂浮,大部分細(xì)胞形態(tài)基本正常,貼壁生長良好。

2.2 RT-PCR檢測survivin mRNA的表達(dá)

實(shí)時(shí)定量PCR檢測survivin轉(zhuǎn)錄水平顯示:BEL-7404細(xì)胞經(jīng)特異性siRNA作用后,與空白組相比較survivin基因的表達(dá)受抑制其Ct值由34.2降低到22.8。PCR產(chǎn)物電泳圖如圖1。

Fig 1 Survivin siRNA expression levels after transfection

2.3 免疫組化檢測結(jié)果

survivin-siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株BEL-7404細(xì)胞時(shí)抑制survivin在細(xì)胞中表達(dá)。siRNA組與空白組細(xì)胞相比,siRNA組細(xì)胞中的survivin蛋白陽性細(xì)胞率降低,由66.2%降為47.4%。免疫組化檢測結(jié)果如下(圖2）。

Fig 2 The expression of survivin protein in BEL-7404 cells after siRNA transfection(×400）

2.4 MTT法細(xì)胞檢測結(jié)果

MTT法檢測結(jié)果顯示,Survivin-siRNA轉(zhuǎn)染對BEL-7404細(xì)胞有明顯的抑制作用,其它組間細(xì)胞的增殖情況無顯著性差異(表1）。

Table 1 MTT assay inhibition of BEL-7404 cells by survivin siRNA(±s,%）

Table 1 MTT assay inhibition of BEL-7404 cells by survivin siRNA(±s,%）

※P＜0.01 vs blank group

24 h(OD值 抑制率） 48 h(OD值 抑制率） 72 h(OD值 抑制率）空白組 0.652±0.015 0.581±0.018 0.469±0.015脂質(zhì)體組 0.670±0.021 0.572±0.019 0.445±0.013 siRNA 對照組 0.628±0.015 0.587±0.015 0.458±0.020 siRNA 組 0.360±0.019※ 44.8% 0.274±0.016※ 52.8% 0.263±0.018※ 48.1%

3 討論

RNAi能高度特異性地降解與其序列高度互補(bǔ)的靶mRNA,而對其它基因的表達(dá)沒有明顯影響,這使得它在醫(yī)學(xué)科學(xué),特別對腫瘤基因治療中具有極高研究價(jià)值。Survivin作為一種新的凋亡抑制因子,在包括HCC在內(nèi)的許多腫瘤中均高表達(dá),因而有可能作為腫瘤治療的一個(gè)特異的攻擊靶點(diǎn),越來越受到國內(nèi)外學(xué)者們的廣泛關(guān)注。有研究報(bào)道,應(yīng)用RNAi技術(shù)對人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721[8]、肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549[9]等干擾Survivin基因的表達(dá),均能有效地促進(jìn)瘤細(xì)胞的凋亡。Moriyama等[10]也設(shè)計(jì)siRNA對survivin基因干擾,發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞明顯凋亡,認(rèn)為survivin是治療黑色素瘤的理想靶點(diǎn)。

本研究通過survivin-siRNA轉(zhuǎn)染高表達(dá)survivin基因的肝癌細(xì)胞系BEL-7404后,來檢測其對BEL-7404細(xì)胞的影響,并評價(jià)沉默survivin基因表達(dá)的抑制作用。MTT法對細(xì)胞活性檢測顯示,siRNA組細(xì)胞生長受抑,siRNA轉(zhuǎn)染組的OD值明顯低于其他各組,其抑制率與空白組相比(P＜0.01）;RT-PCR檢測顯示,BEL-7404細(xì)胞經(jīng)特異性siRNA作用后,與空白組相比較survivin基因的表達(dá)受抑制,其Ct值由34.2降低到22.8;免疫組化檢測亦表明:survivinsiRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株BEL-7404細(xì)胞能有效地抑制survivin在細(xì)胞中蛋白表達(dá),siRNA轉(zhuǎn)染組與空白組細(xì)胞相比,siRNA組細(xì)胞中的survivin蛋白陽性細(xì)胞率降低,由66.2%降為47.4%。表明survivin-siRNA轉(zhuǎn)染具有特異性抑制目的基因survivin的作用,提示RNAi在肝癌細(xì)胞系BEL-7404中可將survivin基因沉默。

利用siRNA建立的RNA干擾肝癌細(xì)胞系中survivin表達(dá)的方法具有較高的特異性和可控性,其抑制目的基因的作用遠(yuǎn)高于其他基因阻斷技術(shù)。但從本研究也發(fā)現(xiàn)siRNA特異性轉(zhuǎn)染對抑制細(xì)胞生長有時(shí)間衰減性,轉(zhuǎn)染后 48 h后 siRNA組抑制率達(dá)52.8%,隨著時(shí)間的延長至 72 h時(shí),抑制率為48.1%。出現(xiàn)這種情況可能與許多的影響因素有關(guān),如選擇不同的siRNA載體,其轉(zhuǎn)染成功率不一,LipofectamineTM 2000脂質(zhì)體對細(xì)胞的毒性,以及RNAi技術(shù)的生物安全性等。隨著RNAi機(jī)制的深入研究和RNAi技術(shù)的不斷完善,它將在防治腫瘤領(lǐng)域展示出廣闊的應(yīng)用前景。進(jìn)一步闡明特異性Survivin-siRNA對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡作用的分子機(jī)制,以期為防治肝癌提供理想的方法和途徑,有著十分重要的理論和實(shí)踐意義。

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