黃嵐峰,邵國喜,張延哲,趙勁松

(吉林大學(xué) 第二醫(yī)院1.骨科;2.眼科,吉林 長春 130041）

隨著生物學(xué)和材料科學(xué)的發(fā)展,組織工程技術(shù)已被眾所周知和越來越多地應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,與此同時,機械工程的方法也比以前更多地與生命科學(xué)相結(jié)合。種子細胞以高活性生長粘附在的基質(zhì)材料的表面是組織工程的研究中至關(guān)重要的問題,本研究的目的是研究間質(zhì)干細胞在向成骨細胞分化過程中觀察通過加在機械振動對MSCs粘附性能和堿性磷酸酶活性的影響,探討一種促進種子細胞以高活性與基質(zhì)材料粘附的方法。

1 材料與方法

1.1 細胞的來源和培養(yǎng)

大鼠Fischer344,7周齡,雌性,共4只作為本實驗的細胞來源。大鼠通過過量的乙醚麻醉處死,然后在潔凈操作臺中取出雙側(cè)的股骨、脛骨和肱骨,在超凈臺中切除股骨松質(zhì)骨的部分,用含10%胎牛血清(FBS）、1%抗生素(Antibiotics）的DMEM(Dulbecco'sModified Eagle Medium）培養(yǎng)液將骨髓腔的細胞沖洗至離心管中,骨髓細胞經(jīng)離心(1 500 rpm）后在T-75培養(yǎng)瓶中進行原代培養(yǎng),4日后首次更換培養(yǎng)液,然后每隔兩日更換培養(yǎng)液同時去除未貼壁的細胞,1周左右待細胞長滿單層后,用5ml PBS沖洗,0.25%Tripsin-0.02%EDTA 3 ml于37℃CO2孵箱中消化細胞約5分鐘,顯微鏡觀察細胞收縮、細胞間裂隙明顯增大,用5 ml DMEM終止消化,并吹打細胞成單細胞懸液,離心后轉(zhuǎn)移至另一試管中,以4.0×104/cm2的密度種植于6孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)液中加入10%FBS,1%Antibiotics,10-8M地塞米松(Dexamethasone）,80 μ g/ml 維 生 素 C(L-Ascorbic Acid）,以 及10mM beta甘油磷酸鈉(Naβ-glycerophosphate）進行成骨細胞活性誘導(dǎo)。

1.2 機械振動的條件

頻率(F）=300Hz,加速度(α）=1.4 gm/s2,振動方向(D）為垂直振動,每次加載振動的時間(T）為6 hours,連續(xù)振動3 days。實驗組細胞傳代培養(yǎng)后立即加載機械振動,對照組(I）不加載機械振動。

1.3 觀察項目

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察每天在加載振動后用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)的改變,并隨機挑選視野拍照,對細胞集落形成分析計數(shù)。

1.3.2 細胞貼壁性分析 加載振動開始計時,以1、2 、3、6 、12、24、48 h 為時間點,觀察實驗組和對照組的細胞貼壁情況,同時隨機選取視野攝片計算機圖像分析,PBS沖洗去除未貼壁細胞后,用0.25%胰酶-0.02EDTA處理后細胞計數(shù)分析細胞貼壁率。

1.3.3 堿性磷酸酶檢測 在細胞培養(yǎng)14 d后于每培養(yǎng)孔中加入界面活性劑NP40 1mL,然后將細胞團加入1 ml微量試管,用超聲波細胞破碎器破細胞膜,4℃、13 000 rpm離心 10 min,取 5 μ l樣本加入另一試管中,同時加入1 ml ALP反應(yīng)劑,CO2孵箱孵育30分鐘,然后加入0.2N NaOH 2 ml終止反應(yīng),測量波長n=410 nm下的吸光度(OD）,同時將ALP反應(yīng)劑作為陰性對照。計算堿性磷酸酶活性(μ mol/30 min/implant）.

Activity(μ mol/30 min/implant）=(sampleOD410nmblankOD410nm）×200/5.91

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡鏡觀察

2.1.1 細胞集落的形成 實驗組在傳代培養(yǎng)后的24 h,可見細胞集落的形成,平均形成數(shù)為39個/35 mmdish,約為4.1/cm2,48 h后細胞集落逐漸融合,長滿單層。對照組中在24 h內(nèi)未見明顯細胞集落形成(圖1）。

2.1.2 細胞貼壁性分析 通過倒置顯微鏡觀察,在最初的48 h中,加載機械振動組貼壁細胞密度明顯高于對照組,統(tǒng)計學(xué)分析顯示在培養(yǎng)后的1、2、3、6、12,24及48 h在兩組之間有顯著性差異(P＜0.05）,72 h后兩組無明顯差異(P＞0.05）,培養(yǎng)7 d后振動組為3.34×105/cm2,對照組為3.33×105/cm2(圖2）。

2.2 ALP檢測

在培養(yǎng)終點14 d時,實驗組細胞堿性磷酸酶活性為 17.31 ±2.43 μ mol/30 min/implant,對 照 組為16.49±3.12 μ mol/30 min/implant,兩組之間堿性磷酸酶活性無明顯差異。

圖1 實驗組MSCs培養(yǎng)后24 h,細胞集落(▲）,40×

圖2 實驗組與對照組細胞密度比較。*P＜0.05

3 討論

在組織工程的研究中,一個十分關(guān)鍵的問題就是細胞如何能夠均一地粘附在基質(zhì)材料中,并且能夠良好的生長繁殖,表達相應(yīng)的細胞活性[1]。它依賴于細胞與細胞之間、細胞與細胞外基質(zhì)環(huán)境之間的粘附作用。這種粘附作用是由細胞表面蛋白家族介導(dǎo)的,被稱為細胞表面粘附分子[2-4]。

本實驗的結(jié)果顯示在傳代后立即加載機械振動,骨髓間質(zhì)干細胞可以更快速、更多數(shù)量地粘附于培養(yǎng)環(huán)境;但是,本實驗的研究結(jié)果只能證明在振動頻率為300 Hz,加速度在1.4 gm/s2的垂直方向的條件下出現(xiàn)的結(jié)果,其它振動條件下對細胞粘附和活性的影響尚有待于進一步研究。并形成細胞集落,顯示良好的細胞活性在此,通過對比研究可以證實,早期加在機械振動對于細胞貼壁具有重要的作用。同時在此研究中我們發(fā)現(xiàn)傳代培養(yǎng)后早期細胞克隆只出現(xiàn)于加載振動的實驗組中,這里的基質(zhì)上有待于進一步的研究,我們認(rèn)為可能是通過機械振動向細胞傳遞了一種能量,這種能量增加了細胞之間以及細胞與細胞外基質(zhì)之間的接觸,使細胞表面的粘附分子更容易被激活,所以使細胞更容易與周圍的基質(zhì)材料粘附在一起,形成貼壁生長,與周圍的細胞粘附在一起形成細胞集落。

細胞粘附的特性不僅取決于細胞表面粘附分子的表達,而且還依賴于細胞外基質(zhì)材料的自然狀況,比如體積、表面蛋白、表面修飾、表面形態(tài)、多孔性以及降解性等細胞與材料之間的界面情況[5]。細胞與細胞之間、細胞與細胞外基質(zhì)之間的粘附特性尚需要進一步定性和定量的研究。有文獻證實通過加在機械振動,可以促進軟骨細胞DNA以及蛋白多糖的合成。通過成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d的ALP檢測結(jié)果顯示實驗組與對照組振動組之間無明顯差異,可以初步判定以本文的方式加載機械振動對MSCs的分泌ALP能力無影響,但MScs分泌產(chǎn)生ALP的能力尚需通過real time PCR等檢測分析其mRNA的表達水平進一步證實。

4 結(jié)論

在細胞粘附生長的過程中通過加載機械振動,可以明顯促進細胞與細胞之間、細胞與細胞外基質(zhì)之間的粘附;該方法可用于組織工程中三維細胞培養(yǎng)和體外構(gòu)建,以獲得種子細胞分布均勻、狀態(tài)良好的組織工程細胞-材料復(fù)合物,但加載機械振動的相關(guān)具體參數(shù)以及對細胞功能活性的影響尚需進一步研究。

[1]Kuberka M,Heschel I,Glasmacher B,Rau G.Preparation of collagen scaffolds and their applications in tissue engineering[J].Biomed Tech(Berl）,2002,1:485.

[2]Mann BK,West JL.Cell adhesion peptides alter smooth muscle cell adhesion,proliferation,migration,and matrix protein synthesis on modified surfaces and in polymer scaffolds[J].J Biomed Mater Res,2002,60(1）:86.[3]Buckley CD,Rainger GE,Bradfield PF,et al.Cell adhesion:more than just glue(review）[J].Mol Membr Biol,1998,15(4）:167.

[4]Arai F,Ohneda O,Miyamoto T,et al.Mesenchymal stem cells in perichondrium express activated leukocyte cell adhesionmolecule and participate in bone marrow formation[J].J ExpMed,2002,195(12）:1549.

[5]Agrawal CM,Ray RB.Biodegradable polymeric scaffolds for musculoskeletal tissue engineering[J].J Biomed Mater Res,2001,55(2）:141.[6]Liu J,Sekiya I,Asai K,et al.Biosynthetic response of cultured articular chondrocytes to mechanical vibration[J].Res Exp Med(Berl）,2001,200(3）:183.