金 宏,溫 娜,紀(jì)鵬艷,王 爽,王樹東,齊 玲*

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心,吉林吉林市 132013;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院心血管中心）

腦腫瘤發(fā)病率目前在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢,腦腫瘤中以膠質(zhì)瘤最為常見,惡性膠質(zhì)瘤是腫瘤患者的第4位死亡原因,具有發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、死亡率高和治愈率低“三高一低”的特點(diǎn)。研究表明,五味子具有保肝、抗腫瘤、抗氧化與抗衰老等作用,但目前對于五味子的研究都主要集中在保肝作用方面,五味子在腦腫瘤中治療作用少有研究。本研究觀察了五味子乙素(Schisandrin B,Sch B）對體外培養(yǎng)腦膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞生長的作用,旨在探討五味子乙素在腦腫瘤細(xì)胞生長中起到的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株腦膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞由吉林大學(xué)提供。

1.2 主要試劑細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640(Thermo）,小牛血清(Gibco）,五味子乙素(中國藥品生物制品檢定所）,胰蛋白酶(Gibco）,四甲基偶氮唑(MTT）(Sigma）,二甲基亞砜(DMSO）(Thermo）。

1.3 腦膠質(zhì)瘤 SHG-44細(xì)胞的培養(yǎng)從液氮中取出凍存的腦膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞,迅速放入37℃水浴箱中復(fù)蘇,然后將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中,加入10 ml含10%小牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液,將其置入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔日換液。

1.4 藥物作用后 SHG-44細(xì)胞生長情況檢測將五味子乙素用85%乙醇溶解后,取適量藥液加入含5%小牛血清RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液,配制成終濃度為 0,50,100,200 μ l?ml-1的藥物。取對數(shù)生長期的腦膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞,用胰酶消化后,用含5%小牛血清RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106ml-1。將細(xì)胞懸液均勻接種于96孔板中,每孔100 μ l,置入 37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h,使細(xì)胞同步化。分別于24、48、72 h棄去上清液,加入含不同濃度的五味子乙素,每個(gè)藥物濃度重復(fù)5次。藥物作用結(jié)束時(shí),每孔加入MTT20 μ l,37℃繼續(xù)孵育4 h,終止細(xì)胞培養(yǎng),棄去上清液,每孔分別加DMSO 150μ l,震蕩均勻使MTT沉淀完全溶解,15 min后在酶聯(lián)免疫檢測儀上490 nm波長處測定各孔吸光度(A）值,用不加細(xì)胞的空白孔調(diào)零。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以ˉx±s表示,組間比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 五味子乙素對體外培養(yǎng)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的影響用不同濃度五味子乙素作用于SHG-44細(xì)胞,結(jié)果顯示:藥物在最初作用的24 h內(nèi),對細(xì)胞生長起到了輕度的刺激作用,細(xì)胞增殖明顯(P＜0.05）。隨著藥物作用時(shí)間的增加,藥物作用48 h時(shí),對細(xì)胞開始呈現(xiàn)明顯的抑制作用(P＜0.05）,72 h時(shí)作用最為明顯(P＜0.01）。說明五味子乙素在短時(shí)間內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞增殖,而48 h及以上時(shí)間,則抑制細(xì)胞生長,并具有一定的時(shí)間和劑量關(guān)系。

表1 不同濃度 Sch B對 SHG-44細(xì)胞的作用(OD值）

3 討論

Sch B屬木脂素類,它是五味子的主要活性成分之一。五味子抗腫瘤作用主要集中在木脂素和多糖部位[1]。其中,Sch B是其抗腫瘤的主要成分之一。Sch B具有毒性小的特點(diǎn)[2]。用五味子乙素單藥處理對SMMC7721無毒性作用[3]。Sch B發(fā)揮抗腫瘤作用主要是通過清除氧自由基、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化及凋亡、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多耐藥性、抑制腫瘤血管生成等機(jī)制來抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。目前對五味子粗提物藥理作用的研究較多,但對五味子乙素的抗腫瘤機(jī)制研究還不夠系統(tǒng)、深入。

Sch B可以通過凋亡早期發(fā)生Caspase-3依賴性途徑和Caspase-9非依賴性途徑誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生凋亡[4]。Sch B和順鉑單獨(dú)應(yīng)用可導(dǎo)致H22肝癌移植瘤細(xì)胞中 caspase-3、8、9表達(dá)增高,聯(lián)合應(yīng)用時(shí)caspase-3、8、9表達(dá)增高更明顯[5]。顧穎等[3]證實(shí),Sch B所促進(jìn)的凋亡是Caspases依賴型的。Sch B能夠顯著促進(jìn)阿霉素在人肝癌細(xì)胞系SMMC7721誘導(dǎo)的凋亡,并證實(shí)這種凋亡是通過caspase-9的激活介導(dǎo)的[6]。

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是治療腫瘤的重要方法。本實(shí)驗(yàn)觀察了不同濃度、不同時(shí)間五味子乙素對體外培養(yǎng)腦膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞生長的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)較高濃度五味子乙素長時(shí)間作用腦膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞后,可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡,對細(xì)胞生長具有明顯的抑制作用。在藥物作用24 h時(shí),細(xì)胞表現(xiàn)為增殖,而48 h和72 h時(shí),則表現(xiàn)為明顯的抑制作用,并有明顯的時(shí)間和劑量效應(yīng)。但Sch B呈現(xiàn)這種明顯的雙效反應(yīng),需要進(jìn)一步研究其作用機(jī)制,明確藥物作用的有效濃度和時(shí)間,以及發(fā)生雙效反應(yīng)的機(jī)制。這從另一側(cè)面提示我們,在用五味子乙素進(jìn)行治療腫瘤時(shí),一定要注意藥物的劑量和治療時(shí)間的長短。

總之,五味子乙素可能通過不同途徑發(fā)揮其抗腫瘤的作用,本實(shí)驗(yàn)用MTT法檢測到五味子乙素高濃度和長時(shí)間作用下明顯抑制體外腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖,說明該藥在誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮一定的作用,進(jìn)一步肯定了五味子乙素在抗腫瘤方面的應(yīng)用價(jià)值。下一步,本實(shí)驗(yàn)將在此研究的基礎(chǔ)上,繼續(xù)探索五味子乙素在誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

[1]鄭占虎,董澤宏,佘 靖.中藥現(xiàn)代研究與臨床應(yīng)用[M].第1卷.北京:學(xué)苑出版社,1997.148-156.

[2]苗明三.五味子多糖對衰老模型小鼠的影響[J].中國醫(yī)藥學(xué)報(bào),2002,17(3）:187.

[3]顧 穎,李 凌.五昧子乙素促進(jìn)多柔比星誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC7721凋亡的研究[J].實(shí)用腫瘤雜志,2006,23(5）:412.

[4]Wu YF,Cao MF,Gao YP,et al.Down-modulation of heat shock protein 70 and up-modulation of Caspase-3 during schisandrin B-induced apoptosis in human hepatoma SMMC-7721 cells[J].World J Gastroenterol,2004,10:2944.

[5]呂冬霞,崔 健,劉月霞,等.五味子乙素聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)H22肝癌移植瘤細(xì)胞凋亡過程中caspase-3,8,9表達(dá)的研究[J].中國老年學(xué)雜志,2009,29(2）:416.

[6]李 玲.五味子乙素增敏蒽環(huán)類的抗腫瘤作用和減輕其心肌毒性的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究[D].杭州:浙江大學(xué),2006.