張家留,張 豐*,殷麗萍,于如同

(1.江蘇省中西醫(yī)結合醫(yī)院,江蘇南京 210028;2.徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院）

膠質瘤是主要的顱內腫瘤之一,其預后不佳。探討膠質瘤發(fā)生過程中增殖、侵襲的的分子病因學機制,以尋找相應的治療靶點是臨床和科研工作中的迫切需求[1]。黏著斑激酶(FAK）的激活,是腫瘤發(fā)生侵襲的重要機制,FAK通過增強整合素和生長因子介導的Ras-MAPK的通路活性,促進腫瘤細胞的轉移。酪氨酸激酶Src是腫瘤早期出現(xiàn)的致癌性蛋白激酶,參與諸如細胞周期、增殖、細胞骨架形成、生長因子信號傳遞等諸多腫瘤生長相關機制[2,3]。Src與FAK關系密切,Src結合并激活FAK,而活化的FAK-Src復合物則通過底物磷酸化介導下游反應。抑癌基因PTEN能通過抑制黏著斑激酶(FAK）和酪氨酸激酶 Src的磷酸化,從而選擇性Ras-MAPK通路[4,5]。但PTEN的泛素連接酶NEDD4-1(neural precursor cell expressed developmentally downregulated 4-1）的過表達能夠下調PTEN的功能,從而促使腫瘤發(fā)生和轉移[6]。

對于Src蛋白在NEDD4-1介導的膠質瘤在侵襲性的作用,目前尚無臨床報道。本實驗擬采用RNA干擾技術(RNAi）,通過抑制Src在膠質瘤U251細胞系中的表達,探索其對下游信號分子蛋白的影響,進一步揭示Src在干擾膠質瘤細胞侵襲中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

本實驗依托徐州醫(yī)學院神經外科及神經生物學實驗室(該實驗室為SPF級重點實驗室）。實驗中的硬件及軟件材料大部分由該實驗室提供,其中實驗中所需的U251細胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學保藏中心）。所需的pcDNA3.1-NEDD4-1質粒由美國Memorial Sloan-Kettering腫瘤中心細胞生物學實驗室提供。pGPU6/GFP/Neo-NEDD4-1質粒由本實驗室構建、保存。pcDNA3.1-Src siNRA質粒均根據(jù)所查相關堿基序列購于上海吉凱基因化學技術有限公司。實驗中所需的抗體:FAK(C-20）(Santa Cruz公司,Sc-558）;FAK(phosphoY397）(Genetex公司,Gtx24803）;山羊抗兔IgG抗體的二抗;小鼠抗人GAPDH單克隆抗體(上海吉凱化學技術公司）

1.2 方法

1.2.1 實驗設計 實驗分4組:(A）pcDNA3.1-空質粒轉染組(B）pcDNA3.1-NEDD4-1組:U251轉染pcDNA3.1-NEDD4-1,(C）pcDNA3.1-NEDD4-1+Src轉染細胞組:U251轉染NEDD4-1及Src,(D）Src siRNA組:U251轉染pcDNA3.1-Src siRNA。最后通過Transwell細胞侵襲實驗及劃痕法遷移實驗觀察膠質瘤U251細胞侵襲情況。

1.2.2 ShRNA表達質粒的構建通過查詢Src基因序列,利用Elbashir[7]等推薦的siRNA設計原則,尋找合適的siRNA靶序列。采用NCBIGenBank(美國國立醫(yī)學圖書館和美國國立衛(wèi)生研究院編寫）提供的BLAST軟件對選擇的靶序列進行同源分析,排除siRNA非特異性地抑制其他基因片段的可能。采用Ambion公司的shRNA在線設計軟件(www.ambion.com）設計可克隆入 pGPU6/GFP/Neo表達載體的shRNA,Src siRN的有效作用靶點:5′-AAGCTGTTCGGAGGCTTCAAC-3′(226-244 bp）購于上海吉凱基因化學技術有限公司。

1.2.3 試驗中通過對該序列質粒DNA小量快速抽提后,并大量制備和純化。然后質粒的穩(wěn)定轉染膠質瘤細胞。轉染24 h后移除轉染試劑,轉染72 h后換完全培養(yǎng)基(1640,加10%的FBS,青霉素、鏈霉素各100 μ g/ml）,分別于轉染后1,3,5,7 d收集細胞檢驗目的基因的活性。最后通過Transwell細胞侵襲實驗(參照Valster A,et al(2005）.Cell migration and invasion assays.Methods37(2）208-215報道方法進行操作。在24孔板中放入轉移培養(yǎng)皿(Transwell,培養(yǎng)皿直徑6.5 mm,微孔徑 8.0 μ m）,轉移培養(yǎng)下室加600 μ l含0.5%的胎牛血清(作為趨化因子）的DMEM。細胞用2 mmol/L EDTA消化、離心,收集并用無血清DMEM洗滌兩次,重懸于無血清DMEM中,調節(jié)濃度至 2×105細胞/ml,取100 μ l細胞懸液加入上室,0.5%結晶紫染色5 min,在200倍顯微鏡下計數(shù)膜下細胞以膜下細胞的數(shù)量多少表示遷移能力。每組細胞進行3次獨立實驗。）及劃痕法遷移實驗(參照Valster A,et al(2005）.Cell migration and invasion assays.Methods37(2）,208-215報道方法進行操作。取80%匯合的細胞,胰蛋白酶消化后以1.2×105個細胞/孔接種于包被有Fn的6孔培養(yǎng)板上,貼壁12 h后換無血清培液培養(yǎng)24 h,細胞基本匯合。用無菌1 ml槍頭垂直在培養(yǎng)板底劃平行、垂直的4對‖劃痕,無血清培液沖洗若干次,以洗去被劃下的細胞。于指定時間點在顯微鏡下從劃痕邊緣遷移出的細胞,每組設雙復孔,反復進行3次獨立實驗。）觀察膠質瘤U251細胞侵襲情況。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

用于分析統(tǒng)計的軟件有sigmastat3.0、spss14.0,實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(ˉx±s）表示。統(tǒng)計分析采用單因素方差分析(ANOVA）,多個實驗組與一個對照組比較采用最小顯著差法(LSD）,實驗組之間比較采用q檢驗(Newman-keuls test）(P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義）。

2 結果

2.1 Src shRNA表達質粒的鑒定

將重組Src shRNA表達質粒轉化感受態(tài)DH5α,提取的質粒用BamHⅠ和PstⅠ內切酶分別單酶切。PstⅠ酶切結果顯示有2條帶,一條為超螺旋的SC構型,一條為質粒的松弛開環(huán)的OC構型。重組體被BamHⅠ單酶切而線性化,條帶大小為232 bp。送目的質粒DNA由上海吉凱生物技術公司完成測序,T3 啟 動 子 引 物 5′-AAGCTGTTCGGAGGCTTCAAC-3′(226-244 bp）,結果顯示插入序列與設計的shRNA堿基序列完全一致,無突變(圖1）。

2.2 重組質粒對U251膠質瘤細胞的影響

U251細胞轉染48 h后,Src siRNA組與空對照組相比,RT-PCR測得Src表達明顯下降,Src+NEDD4-1組Src表達增強,而NEDD4-1組幾乎無太大的變化。實驗組Src shRNA組,Src+NEDD4-1組卻變化較大。并且Src shRNA水平的下調影響其本身以及NEED4-1的表達(圖1）。

2.3 Western blot分析U251細胞中Src蛋白的表達結果

Western blot方法檢測膠質瘤細胞U251中Src的表達情況發(fā)現(xiàn)其Src較正常膠質細胞表達增加。實驗結果顯示,Src蛋白激酶被RNA干擾后的U251膠質瘤細胞和未干擾的U251細胞相比,出現(xiàn)了明顯的G1/S期的阻滯及凋亡率的上升。同時,Src蛋白表達缺失。而Src+NEDD4-1組轉染質粒組Src蛋白表達在各組中最強。ND4組變化不大(圖2）。

圖1 Src shRNA ND4表達質粒的PCR及酶切鑒定

圖2 轉染后Western Blot結果分析

2.4 Src介導NEDD4-1引起的膠質瘤細胞遷移、侵襲性的變化

應用劃痕法測定轉染的四組在U251細胞中遷移能力的變化(圖3-5）。實驗結果顯示:轉染Src+ND4組16 h后向劃痕內遷移的細胞侵襲距離較其他各組呈明顯增強趨勢,而轉染 shRNA質粒的U251細胞16 h后向劃痕內遷移的細胞侵襲距離較其他各組明顯降低。這一發(fā)現(xiàn)提示Src shRNA抑制膠質瘤細胞遷移能力的作用中扮演關鍵的開關角色(如表1）。

表1 轉染各組膠質瘤細胞侵龔距離(±s）

表1 轉染各組膠質瘤細胞侵龔距離(±s）

干擾組與控制組比較,△P＜0.5,干擾組與Src+ND4組間比較,*P＜0.1

分組 侵襲距離(平均差±標準差）CONTROL 86.6±7.1 NEDD4-1 87.2±8.1 Src+NEDD4-1 90.80±10.2 ShR NA 34.9±7.2△*

圖3 Src介導下膠質瘤細胞遷移能力的變化

圖4 T ranswell細胞侵襲實驗分析細胞侵襲能力的變化

進一步用Transwell細胞侵襲實驗分析細胞侵襲能力的變化。實驗結果顯示,轉染Src與NEDD4-1質粒在U251細胞的細胞侵襲性較轉染空載體對照組明顯增強?？梢钥闯鯪EDD4-1與Src質粒的轉染可以促進膠質瘤細胞的侵襲性,而在Src shRNA則通過抑制Src的作用進而抑制U251細胞的侵襲性。

圖5 Src介導下膠質瘤細胞遷移、侵襲性的變化

3 討論

我們在表達Src shRNA重組載體構建成功的基礎上,對其抑制膠質瘤細胞中Src基因表達的效果進行檢測,并觀察Src基因表達下降對膠質瘤細胞生物學特征的影響。

從Transwell細胞侵襲實驗結果分析細胞侵襲能力的變化看出:轉染的Src+NEDD4-1質粒細胞組U251細胞侵襲性較其他各組明顯增強,而Src shRNA通過抑制Src的活性進而抑制膠質瘤U251細胞的侵襲性。同時,應用劃痕法測定轉染的四組細胞中遷移變化得出的結果與Transwel實驗相符?？梢钥闯鯯rc+NEDD4-1質粒轉染可以促進膠質瘤細胞的侵襲性。

Western blot實驗表明膠質瘤U251細胞系中Src蛋白的正常表達(見圖2）。應用Src酪氨酸激酶抑制劑shRNA抑制U251細胞中Src酪氨酸激酶活化,能夠抑制Src的表達;相反,NEDD4-1+Src組與其他三組相比Src蛋白表達明顯增強[8]。

同時大量的文獻發(fā)現(xiàn)Src還作用于整合素依賴性粘附、細胞骨架肌動蛋白重排以及整合素基因表達調節(jié)及信號傳導機制中的二級分子[9]。各種體內外實驗也證實Src腫瘤增值有促進作用。對編碼無激酶活性形式的Src的DNA進行顯微注射,或是壓制識別Src末端保守序列的抗體,都能抑制由GEF,PGDF和CSF誘導的DNA合成。此外,無活性的激酶或是缺少結構域的Src突變體在Src的成纖維細胞中的表達,也能阻斷PGDF誘導的DNA合成。Src的SHZ域是與PDGF受體結合所必需的;SH3域突變的Src突變體干擾了由PDGF和GEF所誘導的NDA合成,證明SH3域在這些生長因子誘導的DNA合成中有重要作用[10]。

與人膠質瘤發(fā)生發(fā)展相關基因的研究進展較快,依據(jù)膠質瘤細胞分化障礙、膠質瘤惡性進展發(fā)生情況,已明確的基因包括KRa,Ink4a-Arfs,PDGF,RB,TP53等[11],尚未涉及到與Src的關系。本研究選擇Src作為靶基因,原因是它在神經節(jié)膠質細胞瘤惡變成多形性膠質母細胞瘤過程中,隨惡性程度增高而表達增加。從目前膠質瘤起源細胞的研究進展來看,這類腫瘤細胞來源于神經元和膠質細胞的共同前體細胞,即神經干/祖細胞的可能性很大[12]。而我們在人胎腦來源的神經干/祖細胞體外分化過程中又發(fā)現(xiàn)了它隨細胞分化程度增高而表達量下降。而Src在膠質瘤體外細胞系高表達,并隨惡性程度增高表達增高[13]。

Src蛋白激酶功能復雜,已經明確的是機體細胞有絲分裂過程中起G1-S期的關鍵作用[14-15],細胞無論是走進還是走出分裂周期都需要它的參與。在G1后期Src與cyclinB1結合形成有絲分裂促進因子(MPF）,它的高表達是腫瘤細胞無限增殖的源動力,已在多種腫瘤中檢測到它的高表達[16-17]。Src高表達還可以通過紡錘體檢查點的改變,促進癌細胞染色體的不穩(wěn)定性[18],因此它又是腫瘤異質性和惡性進展的根源。我們在人腦膠質瘤U251培養(yǎng)的細胞轉染穩(wěn)定表達Src shRNA的重組的實驗結果表明,腫瘤細胞Src被表達干擾后,其侵襲能力顯著下降,增殖周期阻滯在G1/S期,凋亡比例增加。由此以反證法證明了Src在膠質瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用和作為病因分子的潛在靶基因治療的價值。

綜上所述,本研究對Src在膠質瘤中的表達、分布以及Src在NEDD4-1發(fā)揮作用過程中的角色及其下游信號分子進行了初步研究揭示了:NEDD4-1通過Src在細胞的凋亡、腫瘤的發(fā)生及其侵襲性過程中發(fā)揮著重要作用。做為Src的抑制劑Src shRNA在人腦膠質瘤中的表達及對腫瘤細胞生長、侵襲作用可能成為膠質瘤治療的又一靶點。而更為重要的是對NEDD4-1基于Src引發(fā)的一系列信號轉導通路的研究則可能進一步發(fā)現(xiàn)膠質瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲的生物學信息,為最終揭示其生長、侵襲的機制提供依據(jù)。

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